Screen Quest 免洗钾离子通道检测试剂盒
| Ex (nm) | 494 | Em (nm) | 516 |
| 分子量 | N/A | 溶剂 | - |
| 存储条件 | - |
产品货期
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适用范围
用于检测钾离子通道活性
产品介绍
钾离子（K+）通道在调节心率、激素和神经递质分泌、水电解质平衡等基本生物过程中起着关键作用。该通道已成为治疗心律失常、疼痛、糖尿病、神经功能障碍等疾病的潜在药物靶点。目前普遍采用铊离子（Tl+）对K+通道的通透性来检测通道活性：将表达目标K+通道（如hERG、Kv1.3、Kir2.1、KATP等）的细胞预先负载对Tl+荧光染料——该染料本身无荧光且可自由穿透细胞膜，进入细胞后，其AM酯结构会被内源性酯酶水解为带负电荷的荧光团滞留胞内。当加入含低浓度Tl+的刺激缓冲液时，Tl+流经K+通道与染料结合产生荧光信号，其强度与通道活性成正比。若加入阻断剂或激活剂，荧光信号会相应减弱或增强，从而反映K+通道活性受抑制或激活的状态。
适用仪器
| 荧光酶标仪 | |
| Ex: | 490nm |
| Em： | 520nm |
| cutoff: | 510nm |
| 推荐孔板: | 黑色透明底板 |
| 读取模式: | 底部读取模式/分液处理 |
| 其他仪器 | ArrayScan、FDSS、FLIPR、FlexStation、IN Cell Analyzer、NOVOStar、ViewLux; |
样品实验方案
简要概述
1.在生长培养基中准备细胞
2.添加Tl-520 AM染料加载溶液（96孔板：100 µL /孔，384孔板：25 µL /孔）
3.在37°C孵育1小时
4.加入激动剂/拮抗剂，37°C孵育30分钟
5.加入Tl2SO4 / K2SO4刺激溶液（96孔板：50 µL /孔，384孔板：12.5 µL /孔）
6.检测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度
溶液配制
注：所有未使用的储备溶液应分装为单次用量，制备后于-20°C保存，避免反复冻融
储备溶液配制
1. TI-520 AM储备溶液
向TI-520 AM（组分A）瓶中加入20 µL（货号#36550）或200 µL（货号#36551/#36552）DMSO，充分混匀。
注意：未使用的TI-520 AM储备液需避光分装保存于<-20°C，避免反复冻融
2.分析缓冲液（1X）
将1 mL的10XPluronic®F127 Plus（组分B）添加到9 mL的HHBS缓冲液（组分C）中混匀。
注意：10 mL 1X分析缓冲液可满足一块板需求。 未使用的10X Pluronic® F127 Plus需避光分装保存于<-20°C。
3.无氯缓冲液（1X）
将2 mL 5X无氯缓冲液（组分D）与8 mL双蒸水（ddH₂O）混合。
4. Tl2SO4溶液（需自备，Sigma Cat＃208191）
将Tl2SO4溶于超纯水中，终浓度80 mM。
注意：Tl2SO4有毒。 采取必要的预防措施，以防止吸入和皮肤接触。
工作溶液配制
1. TI-520 AM染料加载溶液
将20 µL TI-520 AM储备溶液（500X）加入10 mL的1X分析缓冲液中并充分混合。
2.刺激溶液（5X）
用1X无氯缓冲液稀释配体（用于非电压门控钾通道）或K₂SO₄（用于电压门控钾通道）与Tl₂SO₄。
表1.应针对每个靶标优化参考（HEK293-KCNH2细胞中的电压门控hERG通道），Tl2SO4和K2SO4（电压门控钾通道）或配体（非电压门控钾通道）的浓度及细胞类型。
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组分 |
容积 |
5X 浓度 |
浓度 |
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无氯缓冲液(5X) |
2 mL |
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K2SO4 (250 mM) |
1 mL |
25 mM |
5 mM |
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TI2SO4 (80mM) |
0.5 mL |
4 mM |
0.8 mM |
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ddH2O |
5.5 mL |
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总计: |
10 mL |
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细胞样本制备指南详见：https://www.aatbio.com/resources/guides/cell-sample-preparation.html
实验步骤
1.向细胞板中加入TI-520 AM染料负载溶液（96孔板每孔100 µL，384孔板每孔25 µL）。
2.将负载染料的细胞板置于培养箱孵育1小时，再室温静置15-30分钟。
注意：若需37°C检测，孵育后应立即实验，无需室温静置。
3.用HHBS配制钾通道拮抗剂或激动剂。
4..将细胞板与拮抗剂（抑制实验）在培养箱中孵育30分钟。
5.使用FLIPR、FDSS或Flexstation系统加入5X刺激缓冲液（96孔板每孔50 µL，384孔板每孔12.5 µL）。
6.以490/525 nm波长检测，每1-2秒读取一次荧光信号，持续3分钟。
