百萤推荐：用于细菌活性检测的MycoLight系列产品

本周，百萤生物为大家推荐的是AAT Bioquest研发生产的可替代SYTO^®9检测细菌活性的MycoLight系列产品（代表产品：#MycoLight Green JJ98、#MycoLight Red JJ94）。与碘化丙啶（PI）结合使用后具有更理想的荧光效果和更低的细胞毒性。感兴趣的朋友一起来看看吧！

专有的细胞渗透性核酸探针SYTO®9在微生物学中通常用作单独的染料，或与碘化丙啶（PI）一起用于细菌活性的检测。MycoLight Green JJ98和MycoLight Red JJ94等可渗透细胞的荧光团是SYTO®9的 替代品，提供了同等敏感性和更少缺点。 MycoLight Green JJ98在细菌活性检测中与PI结合使用时表现出近乎理想的结果，其光谱与SYTO®9非常相似，并且在流式细胞仪和荧光显微镜的通用仪器设置下性能略有提高。

材料和方法

如同其它NA探针，包括SYTO ^® 9，MycoLight 染料具有 小的固有荧光，当结合于核酸时荧光呈指数增加。MycoLight Red JJ94优先标记革兰氏阳性细菌、MycoLight Green JJ98可同时标记革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

使用MycoLight Red JJ94和SYTO®9染色后细菌细胞毒性比较

在对数生长期的大肠杆菌培养物，均以2.5 µM的浓度添加MycoLight Red JJ94和SYTO®9，持续10分钟，或以1％DMSO为对照。 两种荧光团均使用DMSO作为基础溶剂，因此将低剂量的DMSO作为合理的对照。 尽管DMSO具有毒性，但浓度为1％时，细菌的抑制作用很小。 为了测量细菌种群的变化，使用分光光度计在7小时内获取600nm处的光密度（OD）读数。 较高的读数为较高的细菌种群，表明其正在生长。

MycoLight Green JJ98细菌活性检测试剂盒有效性研究

将对数生长期的大肠杆菌 HST08 培养物在0.85％NaCl溶液中稀释至〜10⁷细胞/ mL的平均密度，然后平均分配。一种培养物保持不变，并作为100％生活细菌种群的阳性对照；将另一种培养物用乙醇处理，直到种群由70％的死菌组成，以作比较。除去每种培养物的三分之一，并合并为第三个菌落以代表混合种群。将等体积的MycoLight Green JJ98和PI混合，并按染料与细菌的比例为1：250（每1 mL细菌溶液约4 µL染料）添加到培养物中。将溶液充分混合，然后在成像前于室温在黑暗中孵育15分钟。

活细菌中MycoLight Green JJ98和MycoLight Red JJ94的荧光成像

将MycoLight Green JJ98加入浓度为5 µM 的对数生长期的大肠杆菌培养物中，涡旋混合，然后在黑暗中孵育30分钟，然后成像。将MycoLight Red JJ94以2.5 µM的浓度添加到对数生长期的青红球菌培养物中，涡旋混合，然后在黑暗中孵育20分钟，然后成像。

结果与讨论

1.使用MycoLight Red JJ94和SYTO®9染色后细菌细胞毒性比较

图1.随时间推移添加1％DMSO（对照），MycoLight Red JJ94和SYTO®9的大肠杆菌LB培养物的光密度（OD600 nm）。 SYTO®9明显抑制细菌生长，而MycoLight Red JJ94与正常细菌生长完全相容。

如图1所示，SYTO®9在不到一半的实验时间内就对细胞产生了毒性，而MycoLight Red JJ94与对照组相比仅有很小的变化。 MycoLight Red JJ94与细菌生长的相容性不仅可以进一步鉴定细菌，还可以实现正常的细胞行为。 特别是在研究抗生素和活性随时间变化的实验中，这种兼容性至关重要。

2.MycoLight Green JJ98细菌活性检测试剂盒有效性研究

图2.用MycoLight 细菌活性检测试剂盒染色的大肠杆菌HST08的荧光图像。 具有完整细胞膜的活细菌绿色荧光（左），而具有受损膜的70％酒精杀死的死细菌（右）显示红色荧光。 还可以在混合种群（中）中看到活的和死的大肠杆菌细菌细胞。 使用配备有FITC / Texas Red滤光片组的Keyence荧光显微镜拍摄图像。

使用3个大肠杆菌菌落进行的细菌活性检测的结果准确指示了活细菌和死细菌细胞的已知比率。 通过使用MycoLight Green JJ98代替SYTO®9作为细胞可渗透的NA探针，可以 大程度地减少与PI发生荧光冲突的问题。

3.活细菌中MycoLight Green JJ98和MycoLight Red JJ94的荧光成像

图3.将大肠杆菌用5 µM MycoLight Green JJ98染色30分钟，并用Keyence荧光显微镜通过FITC通道以20x成像。

MycoLight Green JJ98如图3所示，每一个细菌细胞的轮廓清晰，表明来自背景噪声的信号比率良好。敏感染料可用于定量低密度样品，亮度可用于需要更精细调整的应用和需要非常低染料浓度的困难细胞系。

图4.用2.5 µM MycoLight Red JJ94将庆生红球菌染色20分钟。 通过具有Cy5滤光片组的Keyence荧光显微镜拍摄图像。

当用MycoLight Red JJ94标记时，革兰氏阳性青霉菌R. qingshengii具有良好的信噪比。其他细菌菌株可能需要调整染料加载过程，但MycoLight Red JJ94与所有测试的菌株均兼容，并根据仪器，细胞密度和其他因素进行微小调整便可进行检测。

4.MycoLight Green JJ98、SYTO®9和PI的光谱比较

图5. MycoLight Green JJ98，SYTO®9和PI的激发和发射曲线。

表1.荧光染料的峰值强度百分比比较。

MycoLight Green JJ98具有4％荧光强度的轻微调整，更重要的是在流式细胞仪和荧光显微镜上常用的绿色滤波片波长范围内的使用情况非常理想。与SYTO®9的42％相比提高到51％，即使在低密度样品中也拥有可靠、稳定的信号。 当MycoLight Green JJ98用作独立探针时，此灵敏度可使用户针对理想信号水平优化染料浓度。 这种灵活性使多参数成像更加容易，其中靶标的表达水平可能不同，而染料强度不匹配可能会使较弱的信号消失。