使用iFluor 琥珀酰亚胺酯染料标记蛋白质

iFluor™染料是一系列出色的荧光标记染料，可跨越整个可见光谱。所有iFluor™染料均具有出色的水溶性。它们的亲水性可大程度地减少有机溶剂的使用。与经典的荧光标记染料（如FITC，TRITC，TexasRed®，Cy3®，Cy5®和Cy7®）相比，iFluor™染料还具有更好的标记性能。我们的某些iFluor™染料在某些抗体上的性能明显优于AlexaFluor®标记染料。它们是用于标记蛋白质和核酸的的荧光染料。每种iFluor™染料都经过开发以匹配特定AlexaFluor®或其他标记染料（例如DyLight™染料）的光谱特性。

事实证明，琥珀酰亚胺（NHS）酯是用于胺修饰的佳试剂，因为所形成的酰胺键与天然肽键基本相同且稳定。这些试剂通常是稳定的，并且与脂族胺显示出良好的反应性和选择性。将琥珀酰亚胺酯化合物用于共轭反应时，需要考虑的因素很少：1）溶剂：在大多数情况下，应将活性染料溶于无水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO）中。2）反应pH：胺与琥珀酰亚胺酯的标记反应强烈依赖于pH。胺反应试剂与非质子化的脂肪胺基团反应，包括蛋白质的末端胺基和赖氨酸的e-氨基。因此，胺酰反应通常在pH 7.5以上进行。被琥珀酰亚胺酯修饰的蛋白质是具有代表性的，通常在pH8.5-9.5下合成。3）反应缓冲液：当使用与胺反应的试剂时，必须避免使用含有游离胺（例如Tris和甘氨酸和硫醇化合物）的缓冲液。广泛用于蛋白质沉淀的铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）在进行染料偶联之前也必须除去（例如通过透析）。4）反应温度：大多数偶联是在室温下完成的。但是，对于特定的标记反应，可能需要升高或降低温度。

图1.NHS脂和伯胺的偶联反应

储存及处理

iFluor™染料应在<-15℃下保存，并避光和防潮。重组后的iFluor™染料的DMSO储备溶液可以在<-15℃下保存大不可超过两周。蛋白质偶联物应在载体蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5 mg / mL的浓度存储。当在2 mM叠氮化钠存在的情况下避光保存时，缀合物溶液可以在4°C下保存两个月而不会发生明显变化。为了更长的存储时间，可以将蛋白结合物冻干或分成单份使用，并保存在≤–60°C下，并避光。

样品标记方案

该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与iFluor™647 SE的缀合物而开发的，仅用于实验参考。实际应根据您的特定需求进行修改。

1. 制备蛋白质储备溶液（溶液A）
   1. 将100 µL反应缓冲液（例如1 M碳酸钠溶液或pH值为9.0的1 M磷酸盐缓冲液）与900 µL目标蛋白溶液（例如抗体，如果可能，蛋白浓度> 2 mg / mL）混合，得到1 mL蛋白质标记储备液。

      注意1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，请使用1 M碳酸氢钠溶液或1 M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH值调整为8.0-9.0。

      注意2：蛋白质应溶于1X磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2-7.4。如果将蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须在pH 7.2-7.4的1X PBS中进行透析，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。

      注意3：不纯的抗体、稳定的牛血清白蛋白（BSA）或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。叠氮化钠或硫柳汞可以通过透析或离心柱去除，以获得佳标记效果。

      注意4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，结合效率会大大降低。为了获得佳标记效率，建议终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

2. 制备染料储存溶液（溶液B）
   1. 将无水DMSO加入iFluor™SE染料小瓶中，制成10-20 mM储备液，混合均匀。

      注意1:开始缀合之前，请准备染料储备溶液（溶液B），立即使用。染料储备溶液的长时间储存​​可能会降低染料活性。避开光线和水分，溶液B可以在冰箱中保存两周。避免冻融循环。

3. 确定佳染料浓度与蛋白质的比例

   每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能有害地影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用一系列不同量的标记染料溶液重复步骤4和5，以实验方式确定佳的染料/蛋白质比例。通常，大多数染料-蛋白质偶联物建议使用4-6种染料/蛋白质。

   1. 以溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的10：1摩尔比为起点：将5 µL染料储备溶液（溶液B，假定染料储备溶液为10 mM）添加到蛋白质瓶中。溶液（95 µL溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg / mL，蛋白质的分子量为〜200KD，则蛋白质的浓度为〜0.05 mM。

      注意1：蛋白质溶液中DMSO的浓度应小于10％。

   2. 运行缀合反应（请参见下面的步骤4）。
   3. 重复步骤3b，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1；15：1和20：1。
   4. 使用预制的旋转柱纯化所需的结合物。
   5. 计算上述4种结合物的染料/蛋白质比率（DOS）
   6. 对以上4种结合物进行功能测试，以确定佳的染料/蛋白质比率，以扩大标记反应的范围。
4. 进行共轭反应
   1. 在有效摇动下，将适量的染料原液（溶液B）添加到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中。

      注意1：溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的佳摩尔比由步骤3f确定。如果跳过步骤3，我们建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10：1。

   2. 在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
5. 共轭物纯化

   以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例。

   1. 按照准备Sephadex G-25色谱柱。
   2. 将反应混合物（直接来自步骤4）加载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。
   3. 一旦样品刚好在顶部树脂表面下方运行，就添加PBS（pH 7.2-7.4）。
   4. 向所需样品中添加更多PBS（pH 7.2-7.4），以完成柱纯化。合并包含所需染料-蛋白质缀合物的级分。

      注意1：要立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，若一次用不完请分装，选择恰当的储存方式保存。

      注意2：为了长期保存，染料-蛋白质结合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

染料-蛋白质缀合物的表征

取代度（DOS）是表征染料标记蛋白的重要因素。较低DOS的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但是较高DOS的蛋白质（例如DOS> 6）也往往具有减弱的荧光。对于大多数抗体，佳DOS建议在2到10之间，具体取决于染料和蛋白质的特性。为了有效标记，应将取代度控制为对一摩尔抗体具有4-10摩尔iFluor™647 SE。以下步骤用于确定iFluor™647 SE标记的蛋白的DOS。

1. 测量吸收率：
   1. 要测量染料-蛋白质偶联物的吸收光谱，建议根据染料的消光系数将样品浓度保持在1-10 mM的范围内。
2. 读取280 nm处的OD（吸光度）和染料大吸收率（iFluor™647染料的_λmax = 649 nm）：
   1. 对于大多数分光光度计，样品（来自色谱柱的馏分）需要用去离子水稀释，以使OD值在0.1至0.9的范围内。280 nm处的OD（吸光度）是蛋白质的大吸收，而649 nm是iFluor™647 SE的大吸收。要获得准确的DOS，请确保结合物不含非结合物染料。
3. 使用以下方程式计算DOS：
   1. 计算蛋白质浓度

      [蛋白质] = [A280-（染料的大吸收量OD x 280nm处的CF）] /蛋白质消光系数] x稀释倍数

   2. 计算染料浓度

      [染料] = [大吸收/染料消光系数时的OD] x稀释系数

   3. 计算标记度：

      DOS = [染料] / [蛋白质] = [ ^d OD ₆₄₉ X ^P ε ₂₈₀ ] / [250000 X（A ₂₈₀ - 0.03A ₆₄₉）]

[染料]是染料的浓度，可以根据Bee-Lambert定律轻松计算：A =ε 染料 CL。[蛋白质]是蛋白质浓度。如果结合效率足够高（优选> 70％），则可以通过重量（添加到反应中）估计该值，或者根据比尔-朗伯定律更准确地计算出：A =ε 蛋白 CL。例如，IgG的ε值为203,000cm^-1 M^-1。P ε 280在280nm处蛋白质的摩尔消光系数（例如IgG的摩尔消光系数是203000cm^-1 M^-1）。CF（280 nm处的染料吸收校正因子）= OD 280 / OD 649对于iFluor™647染料SE = 0.03。250,000 cm^-1 M^-1是iFluor™647 SE的摩尔消光系数。

附录1. iFluor™荧光标记染料的光谱特性