活细胞——流式细胞仪周期分析

 

        今天百萤生物带您了解一下流式在活细胞上的应用。流式细胞术是一种常用的技术，可根据其物理和化学特征分析复杂细胞群。当与荧光标记组合时，可以根据各种参数监测和定量评估细胞组分，例如大小，内部复杂性或通过特定细胞标记物（例如脂质，蛋白质或DNA含量）的表达。在利用DNA结合染色的应用中，流式细胞术分析具有根据细胞DNA含量筛选，表征和荧光分选整个细胞群的能力。这对于解决细胞周期主要阶段的细胞分布尤其重要，估计以分数DNA含量为特征的凋亡细胞的频率，并揭示分析的细胞群的倍性。从该方法收集的数据已经证明在关注细胞生长和发育，增殖和肿瘤发生，细胞周期调节，药物发现和肿瘤学的研究领域中非常有用。

 

真核细胞周期

        真核细胞周期包括细胞生长，复制和分裂的一系列事件。它描述了细胞通过分裂循环的进展，分裂循环由细胞质和核事件控制，受细胞周期蛋白依赖性激酶及其细胞周期蛋白伴侣控制。在给定的群体中，细胞将分布在细胞周期的三个主要阶段中：G ₀ / G ₁期，S期和G ₂ / M期。细胞周期的这些阶段中的细胞分布取决于它们在细胞DNA含量上的差异，并且借助于DNA结合染色，可以高灵敏度地定量评估这些变异。

        在流式细胞术中，细胞DNA含量被称为DNA倍性。在预复制G ₀ / G ₁期，细胞通过合成RNA和蛋白质诱导生长，而DNA含量保持不变。在细胞周期的这个阶段，细胞具有1的DNA倍性，并且当染色时，显示出与其DNA含量成比例的荧光强度。已进入细胞周期的G ₂ / M期的细胞含有双倍量的细胞DNA。因此，这些细胞的DNA倍性等于2，因此荧光强度是G ₀ / G ₁期细胞的两倍。在S期，细胞经历DNA复制并含有不同量的DNA（超过G₀ / G ₁相细胞但少于G ₂ / M期细胞）。S期细胞的特征在于DNA倍性在1至2之间，并且表现出的荧光强度大于G ₀ / G ₁期细胞但小于G ₂ / M期细胞。

 

用于细胞周期分析的Supravital染色

        分析活细胞中的细胞周期进展需要使用细胞渗透性DNA结合染料。在该方法中，将细胞与化学计量结合至DNA的染料一起温育。这意味着染料与每个细胞中存在的DNA的量成比例地结合，并且当被激光激发时将产生与其细胞DNA含量成比例的信号。传统上，使用Hoechst染料进行活细胞中的流式细胞术细胞周期分析。虽然细胞渗透性，但Hoechst染料需要紫外线激发，这会破坏细胞DNA并增加其他通道中的背景干扰。

        为了解决这个限制，AAT Bioquest ^®已经开发出三种Cell Meter™荧光活细胞周期检测试剂盒用于常见的405nm紫激光或488nm蓝光激光。这些分析是活细胞中DNA含量流式细胞仪分析的理想工具，因为它们在细胞周期的各个阶段进行。利用与前述相同的方法，将细胞群与化学计量结合的，细胞可渗透的DNA染料一起温育。在DNA结合后，染料将经历显着的荧光增强，发出与细胞DNA质量成比例的信号。可以通过流式细胞术确定给定样品中处于G0 / G1期，S期和G2 / M期的细胞百分比，以及凋亡前的亚G1期细胞。收集的荧光数据可用于生成直方图，说明循环的每个阶段中细胞的分布（图1）。

图1.生长和诺考达唑处理的Jurkat细胞中的DNA图谱.Jurkat细胞不具有（A）或具有在37℃，5％CO 2培养箱中培养24小时100毫微克/毫升诺考达唑 （B）进行处理，然后染料装载有核绿色™CCS1 30分钟。使用FITC通道，用ACEA NovoCyte流式细胞仪测量核绿色 CCS1的荧光强度。在生长Jurkat细胞（A）中，用核绿 CCS1染色的核显示出G1，S和G2期。在诺考达唑处理的G2阻滞细胞（B）中，G2细胞的频率显着增加，G1和小号期的频率显着下降。    

 

        使用Cell Meter 荧光活细胞周期分析标记活细胞群的方案简单且稳健。因为这些染料是DNA选择性的，所以不需要对细胞群进行RNA酶处理以减少背景干扰。另外，核Violet ，Nuclear Green CCS1和Nuclear Red CCS2（每种试剂盒的染料组分）作为预配制溶液提供，因此不必重构。只需将细胞与染料一起孵育，然后使用流式细胞仪监测细胞群，无需洗涤。 

        Cell Meter 荧光活细胞周期分析的另一个明显优势是流式细胞分析中多路复用应用的能力。Cell Meter 荧光活细胞周期分析有三种不同的颜色选择，可用于紫激光或蓝光激光。这些选项使研究人员能够灵活地在其流式细胞仪上指定其他通道，以分析不同的参数。Nuclear Violet 染色利用通常可用的405 nm激发源，而Nuclear Green CCS1和Nuclear Red CCS2染色利用488 nm激发源。这使得能够同时共染色细胞群用于其他参数，例如GFP细胞的分析，CFSE细胞追踪，细胞分选和免疫表型分析。甲荧光光谱观察者可以帮助确定用于多重分析的理想染料组合。正在考虑的荧光团应具有小的光谱重叠，以减少任何渗透或溢出效应。

 

图2. Nuclear Violet ，Nuclear Green CCS1和Nuclear Red CCS2的激发和发射光谱。Nuclear Violet 被405 nm紫激光有效激发，可以使用DAPI通道进行可视化。Nuclear Green CCS1被488 nm蓝色激光有效激发，可以使用FITC通道进行可视化。Nuclear Red CCS2被488 nm蓝色激光有效激发，可使用Cy3 / TRITC通道进行观察。

 

附:

 

细胞样品制备：流式细胞术测定

应根据个体评估每个细胞系以确定佳细胞密度。为了从板上分离贴壁细胞，建议使用0.5 mM EDTA。可以考虑酶试剂（例如胰蛋白酶，Accutase ），但需要进行测试以确保细胞表面上的目标受体不受影响。

 

贴壁细胞

1. 在使用前在细胞生长培养基中平板细胞为400,000至800,000个细胞/ mL。

 

非贴壁细胞

1. 离心细胞并小心丢弃上清液（即培养基）。
2. 将细胞沉淀重悬于500μL - 1 mL细胞生长培养基或HHBS中，浓度为500,000至1,000,000细胞/ mL。

 

流式细胞仪活细胞周期分析的样本方案

1. 对于每个样品，将细胞制备在5 mL温热培养基或所选缓冲液中，密度为5×10 ⁵至1× 10 ^6个细胞/ mL。
   注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的佳细胞密度。
2. 用测试化合物处理细胞一段所需的时间以诱导细胞凋亡或其他细胞周期功能。
3. 将5μL的200X Nuclear Green CCS1（组分A）加入含有生长培养基的细胞中，并将细胞在37℃，5％CO 2培养箱中孵育30至60分钟。
   注意：对于粘附细胞，用0.5 mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整，并在与Nuclear Green CCS1孵育之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。
   注意：适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。
   注意：由于Nuclear Green CCS1具有细胞渗透性，因此无需在DNA染色前固定细胞。
4. 可选：将细胞以1000 rpm离心4分钟，然后将细胞重新悬浮于0.5 mL测定缓冲液（组分B）或您选择的缓冲液中。
5. 使用488nm蓝色激光（Ex / Em = 490 / 525nm）通过流式细胞术监测荧光强度。

 

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