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百萤小科普:一种新的蛋白质交联抗体的标记和修饰方法

介绍


现在的研究中,一个大生物分子与另一个大分子的共价结合,如抗体与酶或酶与DNA的共价结合,仍是研究人员实验中的重点之一。其中有几种方法可用于交联两个生物分子。一种常见的方法是使用一种小分子交联剂(如Sulfo-SMCC)。SMCC的一端有胺反应性NHS酯基与蛋白质的游离胺(-NH2)反应,另一端有巯基反应性马来酰亚胺基与要结合的生物分子的巯基(-SH)反应,从而形成缀合物。 蛋白质上的SMCC修饰的连接基极不稳定,并且经常自反应,因为蛋白质通常同时包含游离胺基和巯基,所以会导致大量的相同蛋白质发生交联反应。 另外,蛋白质上马来酰亚胺基团的数量的定量非常繁杂,而且很难确定两个生物分子在反应中的适当摩尔比,以获得理想的功能和缀合效率。

目前AAT Bioquest已经开发了一种方便有效的交联方法以高缀合产率连接两个生物分子。该方法使用两种独特的交联剂(Buccutite MTABuccutite FOL),MTA和FOL在蛋白质上的交联剂易于控制和定量。 在脱盐柱上除去游离的连接物后,在温和条件下混合,Buccutite MTA活化的抗体和BuccutiteFOL修饰的蛋白质。 纯化基本上是不需要的,并且反应不会发生相同蛋白质交联。

 

实验材料


  • 抗体和酶:山羊抗小鼠IgG和小鼠IgG来自Jackson Immuno Research Laboratories;HRP来自Calzyme,微管蛋白小鼠mAb来自Life Technologies。
  • 纯化柱:所有纯化柱均为Bio-Rad的Bio-Spin尺寸柱。
  • 细胞成像:HeLa细胞用4%甲醛固定,并用Mouse Anti-tubulin染色,然后用HRP-山羊-抗小鼠IgG缀合物染色。最后用Olympus IX71荧光显微镜拍摄图像。

 

缀合原理


  1. 用MTA激活山羊抗小鼠IgG,并用FOL修饰蛋白(APC或PE)(1小时)。
  2. 活化的IgG和修饰的蛋白用旋转柱纯化(5分钟)。
  3. 将激活的抗体和修饰的蛋白混合(30分钟)。
  4. 用所需的缀合物染色细胞,无需进一步纯化。

图1. Buccutite 抗体-蛋白质缀合过程。

 

结果


用于ELISA检测的Buccutite HRP-IgG缀合物

图2.通过使用Buccutite 交联方法(红色)和SMCC方法(蓝色)制备HRP-山羊-抗小鼠IgG缀合物生成的ELISA曲线图。将小鼠单克隆抗体(100 ng)包被在96孔板上,用标准方法将GAM IgG-HRP缀合物稀释2倍。然后使用ABTS底物溶液(#11001,AAT Bioquest)孵育30分钟,检测固定的小鼠IgG,并在405 nm处读数。

用于细胞成像的Buccutite IgG-RPE缀合物

图3.微管蛋白在HeLa细胞中使用RPE-山羊-抗小鼠IgG缀合物染色的荧光图像。用小鼠抗α-微管蛋白抗体将微管蛋白染色,并用如上所述的Buccutite 交联方法制备红色荧光RPE-山羊-抗小鼠IgG缀合物,最后在显微镜下观察。

 

染料说明


  • 交联剂非常稳定,Buccutite 交联反应试剂激活的大分子非常稳定,可以在4ºC下保存超过24个月。
  • 缀合条件非常简单,Buccutite 缀合物可以在很宽的pH值、浓度和温度下实验,且不需要催化剂。
  • 高效,Buccutite 缀合可在1小时内完成。在相同条件下,与其他现有方法相比,Buccutite 缀合反应具有更高的效率。缀合可以在极低的浓度下进行。

 


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