Amplite 胆固醇定量试剂盒

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适用范围

用于胆固醇定量检测

 

产品介绍

胆固醇作为细胞膜结构与功能的重要组成成分，在生理温度范围内具有调节膜流动性的关键作用。作为细胞内重要的前体分子，胆固醇参与多种生化代谢途径，是维生素D及类固醇激素（包括肾上腺激素皮质醇、醛固酮以及性激素孕酮、雌激素和睾酮等）生物合成的必需原料。

Amplite®胆固醇定量试剂盒采用高灵敏度检测方法，基于胆固醇氧化酶介导的酶偶联反应体系。在胆固醇存在条件下，通过Amplite® Red荧光探针检测反应过程中产生的过氧化氢浓度，从而精准定量胆固醇含量。该检测原理为：胆固醇浓度与酶偶联反应循环中生成的过氧化氢量成正比，而在过氧化物酶作用下，Amplite® Red的荧光强度与过氧化氢浓度（即胆固醇浓度）呈线性相关。本检测可使用荧光酶标仪直接读数。

样品实验方案

简要概述

准备胆固醇检测工作溶液（50μL）
添加胆固醇标准品和/或测试样品（50μL）
在37°C孵育30分钟
在Ex / Em = 540 / 590nm处监测荧光强度

 

溶液配制

1.储备溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融。
1.1 Amplite 红色储备液（250X）：
将40μLDMSO（组分E）加入到Amplite Red底物（组分A）的小瓶中。应立即使用原液。任何剩余的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。

注意：避免反复冻融循环。

注意：在硫醇如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇存在下，Amplite Red底物不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的浓度应不高于10μM。 Amplite Red底物在高pH（> 8.5）下也不稳定。因此，反应应在pH 7-8下进行。建议使用提供的分析缓冲液（pH 7.4）。

1.2胆固醇标准储备液（20μM）：
将10μL胆固醇标准品（组分D）加入990μL测定缓冲液（组分B）中并充分混合。

 

2.标准溶液配制

2.1胆固醇标准溶液配制
准备胆固醇标准品（20μM）。 然后在测定缓冲液（组分B）中进行1：3连续稀释，得到约10,3,1,0.3,0.1,0.03和0.01μM系列稀释的胆固醇标准品。 包括非胆固醇缓冲液对照作为空白对照。

 

3.工作溶液配制

胆固醇工作溶液配制：
将5mL测定缓冲液（组分B）加入胆固醇酶混合物（组分C）的瓶中，并充分混合。 在胆固醇酶混合瓶中加入20μLDipiteRed 储备液（250X）。

 

操作步骤

表1.固体黑色96孔微孔板中胆固醇标准品和测试样品的布局。

CS =胆固醇标准（CS1-CS7）; BL =空白对照; TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
CS1	CS1	...	...
CS2	CS2	...	...
CS3	CS3
CS4	CS4
CS5	CS5
CS6	CS6
CS7	CS7

 

表2.每个孔的试剂组成

胆固醇标准溶液	空白对照	测试样品
连续稀释：50μL	测定缓冲液（化合物B）：50μL	50μL

 

胆固醇测定

1.如表1和2中所述，将胆固醇标准品和含有胆固醇的测试样品加入到96孔黑色微孔板中。

2.将50μL胆固醇测定工作溶液加入胆固醇标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（表2），使总胆固醇测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL测定反应混合物。

3.将反应在37℃孵育30分钟，避光。

4.用荧光板读数器在Ex / Em = 530-570nm / 590-600nm（Ex / Em = 540 / 590nm）监测荧光强度。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。