Amplite 胆碱定量试剂盒
| Ex (nm) | 571 | Em (nm) | 584 |
| 分子量 | - | 溶剂 | - |
| 存储条件 | - |
产品货期
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适用范围
用于胆碱定量检测
产品介绍
胆碱及其代谢产物在细胞膜结构完整性、信号传导以及胆碱能神经传递（乙酰胆碱合成）过程中发挥关键作用。作为三甲基甘氨酸（甜菜碱）的前体物质，胆碱通过参与S-腺苷甲硫氨酸合成途径，成为甲基基团的重要供体。胆碱缺乏可能导致肝脏疾病、动脉粥样硬化及神经系统功能障碍。尽管胆碱作为乙酰胆碱和膜磷脂酰胆碱的前体在中枢神经系统中至关重要，但其在精神疾病中的作用机制仍待深入研究。
Amplite®胆碱定量检测试剂盒采用高灵敏度检测技术，基于胆碱氧化酶介导的酶偶联反应体系。通过Amplite® Red荧光探针检测反应生成的过氧化氢浓度，实现对胆碱的精准定量。其检测原理为：胆碱含量与酶偶联反应中产生的过氧化氢浓度成正比，而在过氧化物酶作用下，Amplite® Red的荧光强度与过氧化氢生成量（即胆碱浓度）呈线性相关。本检测既可通过荧光酶标仪读取信号，也可使用吸收酶标仪在~570 nm波长处进行比色测定。
适用仪器
| 荧光酶标仪 | |
| Ex: | 540nm |
| Em： | 590nm |
| cutoff: | 570nm |
| 推荐孔板: | 纯黑色孔板 |
样品实验方案
简要概述
- 准备并添加胆碱标准品和/或测试样品（50 µL）
- 准备并添加胆碱测定工作溶液（50 µL）
- 在室温下孵育15-60分钟
- 检测Ex / Em = 540/590nm时的荧光强度
溶液配制
储备溶液配制
1. Amplite Red储备液（250X）：将40 µL DMSO（组分E）添加到Amplite Red底物（组分A）的小瓶中，应立即使用储备溶液。应将所有剩余的溶液等分，并在-20oC重新冷冻。
注意1：避免重复冻融。
注意2：在存在硫醇（例如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇）的情况下，Amplite Red底物不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应不高于10 µM。Amplite Red底物在高pH（> 8.5）下也不稳定。因此，反应应在pH 7-8下进行。建议使用提供的测定缓冲液（pH 7.4）。
2.胆碱标准储备液（50 mM）：将400 µL ddH2O加入胆碱标准液（组分C）的小瓶中，并充分混合。
注意：未使用的胆碱储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在-20oC下储存。
标准溶液配制
将20 µL胆碱标准储备液（50mM）加到980 µL分析缓冲液（组分D）中，生成1000 µM标准溶液。注意： 稀释的胆碱标准溶液不稳定，应在4小时内使用。将30 µL的1000 µM标准溶液加到970 µL的测定缓冲液（组分D）中以生成30 µM胆碱标准溶液，然后进行1：3系列稀释，以得到10、3、1、0.3、0.1、0.03和0 µM胆碱标准。
工作溶液配制
胆碱测定工作溶液：
将5 mL测定缓冲液（组分D）添加到胆碱探针瓶（组分B）中，并充分混合。在胆碱探针中加入20 µL Amplite Red 储备溶液（250X）。
实验步骤
表1.黑色96孔板中胆碱标准品和测试样品的布局。CS =胆碱标准（CS1-CS7）；BL =空白对照；TS =测试样品。
| BL | BL | TS | TS |
| CS1 | CS1 | ... | ... |
| CS2 | CS2 | ... | ... |
| CS3 | CS3 | ||
| CS4 | CS4 | ||
| CS5 | CS5 | ||
| CS6 | CS6 | ||
| CS7 | CS7 |
表2.每个孔的试剂组成
| 孔 | 容积 | 试剂 |
| CS1 - CS7 | 50 µL | 连续稀释 (0.03 to 30 µM) |
| BL | 50 µL | 缓冲液 (组分 D) |
| TS | 50 µL | 测试样品 |
胆碱测定：
1.如表1和表2所述，将胆碱标准品和含胆碱的测试样品添加到黑色96孔板中。
2.在胆碱标准液，空白对照和测试样品的每个孔中加入50 µL胆碱测定工作溶液（表2），使总胆碱测定体积为100 µL /孔。
注意：对于384孔板，将25 µL样品和25 µL测定反应混合物加到每个孔中。
3.避光保存，室温下孵育反应15至60分钟。
4.使用荧光酶标仪在Ex / Em = 530-570 nm / 590-600 nm（Ex / Em = 540/590 nm）处检测荧光强度。
