Amplite 比色法鞘磷脂酶检测试剂盒 蓝色荧光

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产品优势

采用"即混即读"检测方案，完全兼容高通量液体处理系统。

 

适用范围

用于鞘磷脂酶（SMase）检测

 

产品介绍

鞘磷脂酶（SMase）是一类催化鞘磷脂（SM）水解生成磷酸胆碱和神经酰胺的关键酶。细胞中SMase的激活在应激响应中起重要作用。根据阳离子依赖性和最适pH值的不同，目前已鉴定出5种SMase亚型：溶酶体酸性SMase、分泌型锌依赖性酸性SMase、镁依赖性中性SMase、镁非依赖性中性SMase以及碱性SMase。其中，溶酶体酸性SMase和镁依赖性中性SMase被认为是细胞应激响应中神经酰胺生成的主要来源。

Amplite®比色法鞘磷脂酶检测试剂盒提供了一种高灵敏度的中性SMase活性检测及抑制剂筛选方案。该试剂盒采用Amplite® UltraBlue显色探针，通过间接定量SMase水解鞘磷脂产生的磷酸胆碱来测定酶活性，适用于血液、细胞裂解液等样本的检测。在655nm波长处，吸光度值与磷酸胆碱生成量（即SMase活性）呈正相关。"即混即读"检测方案完全兼容高通量液体处理系统。

 

适用仪器

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光吸收酶标仪
吸收:	655nm
推荐孔板:	透明底板

96孔板测定示例

概述

准备鞘磷脂工作溶液（50μL）

添加SMase标准品和/或SMase测试样品（50μL）

在37°C孵育1-2小时

加入鞘磷脂酶工作溶液（50μL）

在室温下孵育持续1-2小时

监测655nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分的一个小瓶（或瓶）。

 

溶液配制

1.储备溶液配制

1.1鞘磷脂酰胆碱酶标准储备溶液（10 U/mL）：

将含有0.1%BSA的20µL PBS加入鞘磷脂酶标准品（组分F）瓶中，制成10units/mL鞘磷脂酶的标准储备溶液。

1.2Amplite™ UltraBlue储备溶液（200X）：

向Amplite™UltraBlue ( C组分)瓶中加入100 μ L DMSO ( G组分)，制成200 × Amplite™UltraBlue储备液。注：Amplite™Ultra Blue在硫醇(如DTT和2 -巯基乙醇等)存在下不稳定。反应中DTT或2 -巯基乙醇的终浓度应低于10 µ M，Amplite™Ultra Blue在高pH ( > 8.5 )下也不稳定。反应应在p H 7 ~ 8之间进行。

 

2.标准溶液配制

将1 µ L的10units/ mL的鞘磷脂酶标准储备液加入1000 µ L的检测缓冲液( E组分)中，生成10 mU / mL的鞘磷脂酶标准品。取10 m U / m L鞘磷脂酶标准品500 µ L，进行1∶2系列稀释，得到系列稀释的鞘磷脂酶标准品( SMase7 - SMase1)。

注：稀释后的鞘磷脂酶标准储备液不稳定，应在4小时内使用。

 

推荐稀释计算器：https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/13620

 

3.工作溶液配制

3.1.准备鞘磷脂工作液：

将50μL鞘磷脂（组分B）加入5mL SMase反应缓冲液（组分D）中，并充分混合。

注意：应及时使用鞘磷脂工作液。

3.2.鞘磷脂酰胆碱酶工作溶液：

在酶混合液(组分A )瓶中加入5 m L Assay Buffer (组分E )，混匀。在酶标混合液瓶中加入50 μ L 200X Amplite™Ultra Blue储备液，开始测定。

注意：应及时使用鞘磷脂酶工作液，注意避光；较长时间的储存容易造成较高的检测背景。混合物的浑浊度正常；不会对检测性能产生干扰。

 

样本实验方案

表1.将鞘磷脂酶标准品和待测样品置于白色壁/透明底96孔微孔板中。Smase =鞘磷脂酶标准品( SMase1 ~ SMase7 , 0.078 ~ 5 mU / m L)，Bl =空白对照，ts =待测样品。

BL	BL	TS	TS
SMase1	SMase1	...	...
SMase2	SMase2	...	...
SMase3	SMase3
SMase4	SMase4
SMase5	SMase5
SMase6	SMase6
SMase7	SMase7

表2 .每孔试剂组成。

孔	体积	试剂
SMase1-SMase7	50μL	系列稀释液( 0.078 ~ 5m U / m L)
BL	50μL	缓冲液
TS	50μL	测试样品

1.按照表1和表2提供的布局制备鞘磷脂酶标准品( SMase )、空白对照( BL )和待测样品( TS )。对于384孔板，每孔使用25 µ L的试剂，而不是50 µ L。

2.向鞘磷脂酶标准品、空白对照、供试品各孔中加入鞘磷脂工作液50 µ L，使总测定体积为100 µ L /孔。对于384孔板，每孔加入25 µ L鞘磷脂工作液，总体积为50 µ L /孔。

3.反应混合物在37℃孵育1 - 2小时。

4.向鞘磷脂酶标准品、空白对照、待测样品各孔中加入50 µ L鞘磷脂酶工作液，使总测定体积为150 µ L /孔。对于384孔板，每孔加入25 µ L鞘磷脂酶测定工作液，总体积为75 µ L /孔。

5.反应混合物在室温下孵育1 - 2小时。

6.用酶标仪在655 nm处测定吸光度值。