Amplite 比色法黄嘌呤氧化酶检测试剂盒

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产品优势

1. 在100 µL反应体系中可检测低至0.3 mU/mL的黄嘌呤氧化酶活性

2. 96孔或384孔微孔板检测，无需分离步骤即可轻松实现自动化操作

 

适用范围

用于黄嘌呤氧化酶检测

 

产品介绍

黄嘌呤氧化酶（XO）是一种催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，并能进一步将黄嘌呤氧化为尿酸的酶，在嘌呤分解代谢中起关键作用。该酶主要存在于肝脏和空肠中，当肝脏严重受损时会释放入血液，因此血液XO检测可作为肝损伤的诊断指标。黄嘌呤尿症是一种罕见的遗传性疾病，由于缺乏黄嘌呤氧化酶导致血液中黄嘌呤浓度升高，可能引发肾功能衰竭等健康问题。

Amplite®比色法黄嘌呤氧化酶检测试剂盒提供了一种快速、超灵敏的XO活性检测方法，适用于96孔或384孔微孔板检测，无需分离步骤即可轻松实现自动化操作。其检测原理为：黄嘌呤氧化酶催化嘌呤碱基（次黄嘌呤或黄嘌呤）氧化生成尿酸和超氧化物，后者自发降解为过氧化氢（H2O2）。试剂盒采用Amplite® Red底物，支持双信号记录模式，可通过酶标仪在~570 nm波长处读取吸光度信号。经测试，该试剂盒在100 µL反应体系中可检测低至0.3 mU/mL的黄嘌呤氧化酶活性。

 

适用仪器

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光吸收酶标仪
吸收:	570/610nm
推荐孔板:	透明孔板

样品实验方案

简要概述

1.准备并添加XO标准品和/或测试样品（50μL）
2.准备并添加XO Assay工作溶液（50μL）
3.在室温下孵育30-60分钟
4.在OD比为570 / 610nm时读取吸光度增加

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1.1 Amplite 红色储备液（250X）：
将40μLDMSO（组分F）加入到Amplite Red底物（组分A）的小瓶中。应立即使用原液。任何剩余的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。注意：避免反复冻融循环。注意：在硫醇如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇存在下，Amplite Red底物不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应不高于10μM。 Amplite Red底物在高pH（> 8.5）下也不稳定。因此，反应应在pH 7-8下进行。建议使用提供的分析缓冲液（pH 7.4）。

1.2 HRP库存解决方案（500X）：
将100μL测定缓冲液（组分B）加入HRP小瓶（组分C）中。注意：未使用的HRP储备溶液（500X）应分成一次性使用的等分试样并储存在-20 oC。

1.3 黄嘌呤氧化酶（XO）原液：
将200μL测定缓冲液（组分B）加入黄嘌呤氧化酶标准品（组分E）的小瓶中。注意：未使用的XO储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20ºC。

 

2.标准溶液

黄嘌呤氧化酶标准
将10μL1U/ mL XO储备液加入990μL分析缓冲液（组分B）中，制成10 mU / mL XO标准溶液。进行1：3连续稀释，得到约10,3,1,0.3,0.1， 0.03,0.01和0mU / mL连续稀释的XO标准品。

 

3.工作溶液

表1.一个透明底96孔微孔板的XO分析工作溶液（2X）

成分	规格
Amplite 红色储备液（250x）	20ul
HRP（500X）	10ul
黄嘌呤（100X）	50ul
分析缓冲液	5ml
总容积	5.08ml

 

样品分析

表2.在透明底96孔微孔板中的黄嘌呤氧化酶标准品和测试样品的布局。 XOS =黄嘌呤氧化酶标准品（XOS1-XOS7）; BL =空白对照; TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
XOS1	XOS1	...	...
XOS2	XOS2	...	...
XOS3	XOS3
XOS4	XOS4
XOS5	XOS5
XOS6	XOS6
XOS7	XOS7

表3.每个孔的试剂组成

XO标准	空白	测试样本
连续稀释：50μL	测定缓冲液（化合物B）：50μL	50 µL

注意：黄嘌呤氧化酶标准仅用于阳性对照，不应作为酶活性的定量标准。

1.如表2和3中所述，将XO标准品和含有XO的测试样品加入白色透明底部微孔板中。

2.将50μLXOAssay工作溶液加入XO标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（表2），使总XO测定体积为100μL/孔。 注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL测定反应混合物。

3.在室温下孵育反应30至60分钟，避光。

4.用吸光度读数器监测信号强度，OD比为570 / 610nm。