Amplite 荧光法谷胱甘肽GSH/GSSG比率检测试剂盒 绿色荧光

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产品优势

1.能在100 µL反应体系中检测低至1pmol（10⁻¹²mol）的半胱氨酸或谷胱甘肽（GSH）

2.兼容96孔或384孔微孔板检测

3.无需分离步骤，可直接适配自动化系统

 

适用范围

用于检测谷胱甘肽

 

产品介绍

当细胞处于高水平氧化应激状态时，氧化型谷胱甘肽（GSSG）会大量积累，导致GSH/GSSG比值下降。谷胱甘肽还原酶可通过氧化β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）将GSSG循环还原为GSH。监测GSH/GSSG比值并定量生物样本中的GSSG含量，对于评估细胞和组织的氧化还原状态及解毒功能至关重要，这直接关系到谷胱甘肽在抵抗氧化应激和自由基介导的细胞损伤中的保护作用。目前市场上可用于生物体系硫醇定量检测的试剂或试剂盒选择有限，且现有商业化产品普遍存在灵敏度不足或操作流程繁琐等问题。

Amplite®荧光法GSH/GSSG比率检测试剂盒提供了一种超灵敏的定量检测样本中GSH的方法。该试剂盒采用专利非荧光染料，当其与硫醇反应后会发出强荧光。通过一步式荧光检测技术，该试剂盒可在100 µL检测体积中灵敏检测到低至1皮摩尔的半胱氨酸或GSH。本检测支持96孔或384孔微孔板操作模式，无需分离步骤即可轻松实现自动化操作，其荧光信号可通过荧光酶标仪直接读取。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	490nm
Em：	520nm
cutoff:	510nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

核心要点

重要提示 关于GSH:GSSG比值测定，需牢记以下反应方程：

GSSG → 还原反应 → 2 GSH

每1摩尔GSSG还原会生成2摩尔GSH。因此数据分析时，[总GSH]的计算公式为：[总GSH] = 2 × [GSSG]。

例如：若某孔中[GSSG]标准品浓度为5 μM，则该孔的[总GSH]应按10 μM计算。

 

流程概述

1.准备GSH标准品和/或GSSG标准品或待测样本（50 µL）

2.加入GSH工作液（50 µL）

3.室温孵育10至60分钟

4.监测荧光强度变化（激发/发射波长=490/520 nm）

 

储备液配制方法

除非另有说明，所有未使用的储备液均应分装为单次使用量，配制后保存于-20°C，避免反复冻融。

GSH标准溶液（1 mM）

向GSH标准品（组分C）瓶中加入200 µL测定缓冲液（组分B），配制成1 mM（1 nmol/µL）的GSH标准溶液。

 

GSSG标准溶液（1 mM）

向GSSG标准品（组分F）瓶中加入200 µL双蒸水（ddH₂O），配制成1 mM（1 nmol/µL）的GSSG标准溶液。

 

Thiolite™ Green储备液（100X）

向Thiolite™ Green（组分A）瓶中加入100 µL DMSO（组分D），配制成100X Thiolite™ Green储备液。

注：如需提高溶解性，可加入200 µL DMSO配制成50X储备液。

 

标准溶液配制方法

推荐使用连续稀释计算工具：https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/10056

 

GSH或GSSG标准曲线制备

GSH标准曲线（0-10 μM）

1.取10μL GSH标准储备液加入990 μL测定缓冲液（组分B），配制10 μM GSH标准溶液（GSH7）。

注：稀释后的GSH标准溶液不稳定，需在4小时内使用。

2.以10 μM GSH标准溶液为起始浓度，进行1:2倍比稀释，依次获得5、2.5、1.25、0.625、0.3125和0.1563 μM的梯度浓度标准品（GSH6-GSH1）。

 

GSSG标准曲线（0-5 μM） 

1.取10μL GSSG标准储备液加入990 μL测定缓冲液（组分B），配制10 μM GSSG标准溶液。

注：稀释后的GSSG标准溶液不稳定，需在4小时内使用。

2.以10 μM GSSG标准溶液为起始浓度，进行1:2倍比稀释，依次获得5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1563和0.0781 μM的梯度浓度标准品（GSSG7-GSSG1）。

 

工作液配制方法

GSH工作液（GSH-WS）配制

取100 μL 100X Thiolite™ Green储备液加入10 mL测定缓冲液（组分B）中，涡旋混匀。

注意：1.本工作液（GSH-WS）可满足两个96孔板检测需求

           2.该溶液室温不稳定，需在2小时内使用完毕

           3.注意避光保存

替代方案： 可按比例将100X Thiolite™ Green储备液与测定缓冲液混合配制

 

总GSH工作液（TGSH-WS）配制

取5 mL GSH-WS加入GSSG探针（组分E）瓶中，涡旋混匀。

注意：1.本工作液（TGSH-WS）可满足一个96孔板检测需求

           2.该溶液室温不稳定，需在2小时内使用完毕并避光保存

替代方案：

可先配制25X GSSG探针储备液：向组分E瓶中加入200 μL双蒸水，再按比例将该储备液与GSH-WS混合配制TGSH-WS

 

样品示例

表1. 黑色96孔板中GSH标准品、GSSG标准品及测试样品分布