Amplite 荧光法神经鞘磷脂检测试剂盒 红色荧光

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产品优势

1.采用"即混即读"方案，在96孔或384孔板中直接进行，无需分离步骤即可实现自动化操作

2.兼容血液、细胞裂解液等多种样本

 

适用范围

用于神经鞘磷脂检测

 

产品介绍

鞘磷脂（SM）主要分布于细胞膜的外小叶层，尤其在神经组织中含量丰富。作为重要的信号传导分子，其代谢异常会导致尼曼-匹克病和无β-脂蛋白血症等疾病。

Amplite®荧光法神经鞘磷脂检测试剂盒提供目前最灵敏的SM定量及抑制剂筛选方案。该试剂盒采用Amplite® Red荧光探针，通过间接检测鞘磷脂酶（SMase）水解SM产生的磷酸胆碱来实现SM定量（荧光强度与SM含量成正比），兼容血液、细胞裂解液等多种样本。Amplite® Red支持荧光强度与吸光度双模式检测，采用的"即混即读"方案可在96孔或384孔板中直接进行，无需分离步骤即可实现自动化操作。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.准备SMase工作溶液（50 µL）
2.加入鞘磷脂标准品或测试样品（50 µL）
3.在37°C下孵育1-2小时
4.加入鞘磷脂测定混合物（50 µL）
5.在室温下孵育0.5-2小时
6.监视Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度（在570 nm处截止）

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免反复冻融。
1.1 SMase储备溶液（100X）：
将50 µL含0.1％BSA的PBS加入鞘磷脂酶（小瓶B）中，制成SMase储备液（100X）。

1.2 Amplite Red储备液（200X）：
将80 µL DMSO（组分G）加入小瓶Amplite Red（组分C）中，制成200X Amplite Red储备液，避光。

注意：Amplite Red在存在硫醇（例如DTT和2-巯基乙醇）的情况下不稳定。 反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应低于10 µM。 Amplite Red在高pH（> 8.5）时也不稳定。 反应应在pH 7-8下进行。建议将pH 7.4用于测定缓冲液。

 

2.标准溶液

鞘磷脂标准品
向1000 µL SMase反应缓冲液（组分D）中加入2 µL 50 mM鞘磷脂（组分F），得到100 µM鞘磷脂标准溶液（SM7）。取100 µM鞘磷脂标准溶液进行1：3连续稀释，以得到连续稀释的鞘磷脂标准品（SM6-SM1）。

 

3.工作溶液

3.1 鞘磷脂酶（SMase）工作液：
将100X SMase储液的全部内容物（50 µL）加入5 mL SMase Reaction Buffer（组分D）中，并混合均匀，以制备SMase工作溶液。

注意：应立即使用SMase工作解决方案。

3.2 鞘磷脂工作液：
将全部含量（5 mL）的测定缓冲液（组分E）添加到酶混合瓶（组分A）中，并充分混合。 在开始测定之前，将25 µL 200X Amplite Red储备液加到Enzyme Mix溶液瓶中以制成鞘磷脂测定混合物。 注意：鞘磷脂测定混合物应立即使用，并避免光照。 较长的存储时间可能会导致较高的测定背景。

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样品操作及实验分析

表1.黑色素96孔微孔板中鞘磷脂标准品和测试样品的布局。 SM =鞘磷脂标准品（SM1-SM7，0.1至100 µM），BL =空白对照，TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
SM1	SM1	...	...
SM2	SM2	...	...
SM3	SM3
SM4	SM4
SM5	SM5
SM6	SM6
SM7	SM7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
SM1-SM7	50ul	连续稀释液（0.1至100 µM）
BL	50ul	SMase反应缓冲液
TS	50ul	测试样本

1.根据表1和2中提供的布局，准备鞘磷脂标准品（SM），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 µL试剂代替50 µL。注意：根据需要处理细胞或组织样本。

2.将50 µL SMase工作溶液添加到鞘磷脂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使鞘磷脂的总测定体积为100 µL /孔。对于384孔板，向每个孔中添加25 µL SMase工作溶液，总体积为50 µL /孔。

3.将反应混合物在37°C下孵育1-2小时。

4.将50 µL鞘磷脂测定混合物添加到鞘磷脂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使鞘磷脂测定总体积为150 µL /孔。对于384孔板，将25 µL鞘磷脂测定混合物加到每个孔中，总体积为75 µL /孔。

5.将反应混合物在室温下孵育1-2小时（避光）。

6.使用荧光酶标仪在Ex / Em = 540/590 nm（在570 nm截止）处监测荧光的增加。