Amplite 荧光法鞘磷脂酶检测试剂盒 红色荧光

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产品优势

采用"即混即读"方案可实现鞘磷脂酶（SMase）活性的实时监测

 

适用范围

用于鞘磷脂酶检测

 

产品介绍

根据阳离根据阳离子依赖性和最适pH值的不同，目前已鉴定出五种鞘磷脂酶（SMase）分别是1）溶酶体酸性SMase；2）分泌型锌依赖性酸性SMase；3）镁依赖性中性SMase；4）镁非依赖性中性SMase；5）碱性SMase。其中，溶酶体酸性SMase和镁依赖性中性SMase被认为是细胞应激反应中神经酰胺生成的主要来源。

Amplite®荧光法鞘磷脂酶检测试剂盒提供目前最灵敏的中性SMase活性检测及抑制剂筛选方案。该试剂盒采用Amplite® Red荧光探针，通过间接定量SMase水解鞘磷脂（SM）产生的磷酸胆碱来测定酶活性，适用于血液、细胞裂解液等样本检测。

Amplite®荧光法鞘磷脂酶检测试剂盒 红色荧光的荧光强度与磷酸胆碱生成量（即SMase活性）成正比，支持荧光强度与吸光度双模式检测。采用"即混即读"方案可实现SMase活性的实时监测。AAT Bioquest另提供试剂盒cat#13622专门用于酸性SMase活性检测。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

概述

准备鞘磷脂工作溶液（50μL）

添加SMase标准品和/或SMase测试样品（50μL）

在37°C孵育1-2小时加入鞘磷脂酶测定混合物（50μL）

在室温下孵育持续1-2小时

监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度（在570 nm处截止）

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分的一个小瓶（或瓶）。

 

操作方法

 

1.准备鞘磷脂工作液：

将50μL鞘磷脂（组分B）加入5mL SMase反应缓冲液（组分D）中，并充分混合。

注意：应及时使用鞘磷脂工作液。

 

2.制备鞘磷脂酶标准品和/或含鞘磷脂酶的样品：

2.1将20μL含0.1％BSA的PBS加入到鞘磷脂酶标准品（组分F）的小瓶中，制成10单位/ mL鞘磷脂酶标准储备液。

注意：应将未使用的鞘磷脂酶标准储备液等分并保存在-20℃。

2.2将1μL的10单位/ mL鞘磷脂酶标准储备液（来自步骤2.1）加入1000μL测定缓冲液（组分E）中以产生10mU / mL鞘磷脂酶标准品。

注意：稀释的鞘磷脂标准储备液不稳定，应在4小时内使用。

2.3取500μL10mU / mL鞘磷脂酶标准品进行1至2次连续稀释，得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 mU / mL连续稀释的鞘磷脂酶标准品。

2.4将连续稀释的鞘磷脂酶标准品和/或含鞘磷脂酶的测试样品加入固体黑色96孔微量培养板中，如说明书中的表1和2所示。

注意：根据需要处理您的细胞或组织样本。

2.5将50μL鞘磷脂工作溶液（来自步骤1）加入到鞘磷脂酶标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（来自步骤2.4）。

2.6将反应混合物在37℃下孵育1-2小时。

 

3.准备200X Amplite™Red原液：

将80μLDMSO（组分G）加入到Amplite™Red（组分C）的小瓶中以制备200X Amplite™Red储备溶液。

注意1：未使用的Amplite™Red原液应等分并保存在-20℃（避光）。

注意2：在硫醇（如DTT和2-巯基乙醇）存在下，Amplite™Red不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应低于10μM。 Amplite™Red在高pH（> 8.5）下也不稳定。反应应在pH 7-8下进行。建议将pH 7.4用于测定缓冲液。

 

4.准备鞘磷脂酶测定混合物：

4.1将5 mL测定缓冲液（组分E）加入酶混合物瓶（组分A）中，并充分混合。

4.2在开始测定之前，将25μL的200X Amplite™Red储备溶液（来自步骤3）加入到酶混合物溶液瓶（来自步骤4.1）中以制备鞘磷脂酶测定混合物。

注意：应立即使用鞘磷脂酶试验混合物并避光; 较长的储存可能会导致高分析背景。

 

5.运行鞘磷脂酶测定：

5.1将50μL鞘磷脂酶测定混合物（来自步骤4.2）加入鞘磷脂酶标准品，空白对照和测试样品（来自步骤2.4）的每个孔中，以使总鞘磷脂酶测定体积为150μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品，25μL鞘磷脂工作溶液和25μL鞘磷脂酶测定混合物。

5.2在室温下孵育反应混合物1-2小时（避光）。

5.3使用荧光酶标仪在Ex / Em = 540 / 590nm（在570nm处截止）观察荧光增加。