钙离子荧光探针Cal520NHS酯

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产品优势  

1.低背景荧光：与Ca²⁺结合后显著增强荧光信号，能有效降低背景干扰，提高检测灵敏度。

2.多色兼容性：绿色荧光，适用于多通道成像

3.高效偶联特性：含NHS活性基团，可直接偶联抗体/IgG等生物分子

 

适用范围

用于钙离子检测

 

产品介绍

钙离子检测在生物医学研究中具有不可替代的重要价值。通过特异性结合钙离子后产生光谱响应的荧光探针，研究人员得以运用荧光显微镜、流式细胞分析技术、荧光光谱检测以及微孔板荧光读数系统，实现对细胞内游离钙离子浓度变化的精准追踪。其中，Cal-520®已被证实是目前性能好的绿色荧光钙离子指示剂。根据这一特性，我们开发的胺反应性Cal-520® NHS酯衍生物，可通过与IgG抗体或其他载体分子的偶联反应，构建具有靶向性的钙敏感型生物偶联探针，从而实现对特定靶标空间分布区域内钙离子动态变化的选择性监测。

Cal-520® NHS酯标记实验方案

储备液配制

所有未使用的储备液应分装为单次用量，-20℃避光保存，避免反复冻融。

蛋白储备液（A液）

取100μL反应缓冲液（如1M碳酸钠溶液或pH~9.0的1M磷酸盐缓冲液）与900μL靶蛋白溶液（如抗体，建议浓度>2mg/mL）混合，配制1mL蛋白标记工作液。

注意：1.蛋白溶液pH应维持在8.5±0.5，若pH<8.0需用1M碳酸氢钠或pH9.0磷酸盐缓冲液调节

           2.蛋白需溶解于1X PBS（pH7.2-7.4），若存于Tris或甘氨酸缓冲液需透析处理

           3.避免使用含BSA/明胶稳定的抗体或含叠氮钠/硫柳汞的样品

           4.蛋白浓度应保持2-10mg/mL以获得好的标记效率

 

Cal-520® NHS酯储备液（B液）

用无水DMSO配制10mM储存液，涡旋混匀。现配现用，-20℃避光保存不超过两周。

 

标记实验流程

此标记方案是为山羊抗小鼠IgG与Cal-520® NHS酯而开发的。对于您的特定蛋白质，您可能需要进一步优化。

注意：每种蛋白质需要不同的染料/蛋白质比率，这还取决于染料的特性。过度标记蛋白质可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质共轭物会降低灵敏度。

 

运行共轭反应

1.以10:1的摩尔比（B液（染料）/A液（蛋白质））作为起始点：取95μL A液（假设蛋白浓度10mg/mL，MW~200kD，则浓度~0.05mM），加入5μL B液（10mM）。

注意：建议使用B液（染料）/A液（蛋白质）的10:1摩尔比。如果比例过低或过高，分别在5:1、15:1和20:1的染料/蛋白质比下确定合适的比例。

2.室温震荡反应30-60分钟

 

纯化步骤（Sephadex G-25柱示例）

1.按说明书预处理Sephadex G-25柱

2.上样反应混合物（将反应混合物加载到Sephadex G-25柱的顶部。）（来自“运行共轭反应”）

3.样品刚运行到树脂表面下方时，立即加入PBS（pH 7.2-7.4）洗脱

4.持续加入PBS缓冲液（pH 7.2-7.4）进行洗脱，直至目标样品完全流出层析柱。合并含有染料-蛋白偶联物的洗脱组分。

注意：

短期使用建议：如立即使用，必须用染色缓冲液适当稀释偶联物，按实验需求分装为单次使用量

长期保存方案：如需长期储存，染料-蛋白偶联物溶液需要浓缩或冻干。