新型钙离子荧光探针Calbryte-520XL AM

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适用范围

钙离子检测

产品介绍

Calbryte™-520XL, AM 是一种新型、具有细胞膜渗透性且亲和力极低的荧光钙离子指示剂。与其他乙酰氧基甲酯（AM）染料加载方式类似，Calbryte™-520XL AM酯本身不具有荧光；一旦进入细胞，它会被细胞内的酯酶水解并激活。激活后的指示剂成为极性分子，无法再自由穿过细胞膜，从而被有效地截留在细胞内部。

Calbryte™-520XL 对钙离子的亲和力较低，其解离常数（Kd）约为 300 µM，与 Rhod-5N 类似，但其稳定性远高于后者。当环境中存在高浓度钙离子时，Calbryte™-520XL 会产生明亮的荧光信号。它的激发和发射波长与 Fluo-4 相同，因此，基于 Fluo-4 建立的检测方法设置可直接应用于 Calbryte™-520XL 的钙检测。

Calbryte™-520XL 是 Rhod-5N 的理想替代品。我们还提供其钾盐形式（产品号 #20645）、葡聚糖缀合物（产品号 #20648）以及叠氮化物形式（产品号 #20643）。该叠氮化物可通过成熟的点击化学技术，便捷地与载体分子进行偶联。

实验方案

溶液配制

1.原液配制

Calbryte 520XL, AM 原液

在无水 DMSO 中制备 2 至 5 mM Calbryte 520XL, AM 原液。

注意：当在 DMSO 中复溶时，Calbryte 520XL, AM 是透明、无色的溶液。

2.工作溶液配制

Calbryte 520XL, AM 工作溶液

2.1实验当天，将 Calbryte 520XL, AM 溶解在 DMSO 中，或将等份指示剂原液解冻至室温。

2.2在您选择的缓冲液（例如 Hanks 和 Hepes 缓冲液）（货号20011）中用 0.04% Pluronic® F-127 制备 2 至 20 µM Calbryte 520XL, AM 工作溶液。对于大多数细胞系，建议终浓度为 4-5 μM 的 Calbryte 520XL, AM。细胞加载所需指示剂的准确浓度必须根据经验确定。

注意：非离子洗涤剂 Pluronic® F-127 有时用于增加 Calbryte 520XL, AM 的水溶性。可以从百萤购买购买。

注意：如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可将丙磺舒 (1-2 mM) 添加到染料工作溶液中（孔中的最终浓度为 0.5-1 mM），以减少脱酯后染料的外漏。各种 ReadiUse 丙磺舒产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液，均可从百萤购买。

操作步骤

以下是我们推荐的将Calbryte 520XL, AM加入活细胞的方案。 该方案仅提供指南，实际应根据您的特定需求进行修改。

a）将细胞在生长培养基中培养过夜。

b）第二天，将 1X Calbryte 520XL, AM 工作溶液添加到细胞孔板中。

注意：如果您的化合物干扰血清，请在上样前用新鲜的 HHBS 缓冲液替换生长培养基。

c）将载有染料的孔板在细胞培养箱中于 37°C 下孵育 30 至 60 分钟。

注意：孵育染料超过 1 小时可以提高某些细胞系的信号强度。

d）用 HHBS 或您选择的缓冲液（包含阴离子转运蛋白抑制剂，例如 1 mM 丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以去除任何多余的探针。

e）根据需要添加刺激剂，同时使用配备 FITC 滤光片组的荧光显微镜或包含可编程液体处理系统（例如 FDSS、FLIPR 或 FlexStation）的荧光酶标仪在 Ex/Em = 490/525 nm 处测量荧光。