Cell Meter 活细胞Caspase 3/7和磷脂酰丝氨酸PS检测试剂盒
| Ex (nm) | - | Em (nm) | - |
| 分子量 | - | 溶剂 | - |
| 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
产品货期
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产品优势
1.通过结合外翻的PS，特异性监测细胞凋亡过程。
2.兼容荧光显微镜、流式细胞仪和荧光酶标仪三大检测平台
适用范围
用于细胞凋亡检测
产品介绍
Cell Meter 活细胞Caspase 3/7和磷脂酰丝氨酸PS检测试剂盒是一套用于监测细胞功能的专业工具。在细胞凋亡过程中，半胱天冬酶（caspase）的激活是关键事件之一，其中caspase 3/7的活化对凋亡起始至关重要。研究表明，caspase 3/7对肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有底物选择性。本试剂盒采用红色荧光标记物SR-DEVD-FMK作为caspase 3/7活性检测指示剂——该试剂具有细胞膜通透性且无毒，与caspase结合后可将荧光信号保留在细胞内。虽然这种结合会阻断caspase的进一步催化作用，但不会影响凋亡进程的持续推进。
膜联蛋白（Annexins）是一类钙离子依赖性磷脂膜结合蛋白，其中膜联蛋白V（Annexin V）可特异性检测细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸（PS）。PS外翻是凋亡早期/中期的普遍标志，而膜联蛋白V-荧光染料偶联物（Annexin V-dye conjugates）正是通过监测PS的转位来评估凋亡进程。本试剂盒提供的Annexin V-iFluor 488™绿色荧光标记试剂（激发/发射波长=490/525 nm），可与caspase检测同步实现哺乳动物细胞凋亡的双重监测。
试剂盒还包含用于全细胞核标记的Hoechst染料，以及坏死细胞染色剂碘化丙啶（propidium iodide），兼容荧光显微镜、流式细胞仪和荧光酶标仪三大检测平台。所有核心组分均经过优化，并提供标准化实验方案。
适用仪器
| 流式细胞仪 | |
| Ex: | 488 nm |
| Em： | 530/30 nm、575/26 nm、610/20 nm |
| 通道: | FITC, PE, PE-Texas Red 通道 |
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荧光显微镜 |
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| 推荐孔板: | 黑色透明底板 |
| 通道： | FITC 通道用于 Annexin V-iFluor 488™，TRITC 通道用于 TF3-DEVD-FMK |
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荧光酶标仪 |
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| Ex: | 490 nm, 550 nm |
| Em： | 525 nm, 595 nm |
| Cutoff： | 515 nm, 570 nm |
| 推荐孔板: | 黑色透明底板 |
| 读取模式： | 底读模式 |
样品实验方案
简要概述
1.细胞制备：调整细胞密度至2×10⁶ cells/mL
2.以1：150的比例添加TF3-DEVD-FMK和/或Annexin V-iFluor 488，以1：100的比例添加到细胞溶液中
3.将细胞在37°C，5％CO2培养箱中孵育1小时。
4.沉淀细胞，用缓冲液或生长培养基洗涤并重悬细胞
5.检测荧光强度（底部读数模式），参数设置如下
荧光酶标仪
Annexin V-iFluor 488™：激发/发射=490/525 nm（截止波长515 nm）
TF3-DEVD-FMK：激发/发射=550/595 nm（截止波长570 nm）
荧光显微镜：
FITC滤光片组：检测Annexin V-iFluor 488™
TRITC滤光片组：检测TF3-DEVD-FMK
流式细胞仪：
FL1通道：检测Annexin V-iFluor 488™
FL2通道：检测TF3-DEVD-FMK
细胞制备指南详见：
https://www.aatbio.com/resources/guides/cell-sample-preparation.html
储备溶液配制
TF3-DEVD-FMK储备溶液（150X）：
向TF3-DEVD-FMK（组分A）中加入75 µL DMSO，制成150X TF3-DEVD-FMK储备液。
实验步骤
1.根据特定诱导方案将细胞培养至最合适密度（悬浮培养不超过2×10⁶ cells/mL；96孔黑色透明底板培养不超过3×10⁵ cells/100 µL/孔），同时为每个标记条件设置相同密度的未诱导阴性对照组。以下是悬浮培养细胞凋亡诱导的典型方案示例：
2.Jurkat细胞：2 µg / ml喜树碱处理3小时。
1 µM星形孢菌素处理3小时。
HL-60细胞： 4 µg / ml喜树碱处理4小时。
1 µM星形孢菌素处理4小时。
注意：需根据细胞系特性单独评估最合适诱导密度
3.按1:150比例加入150X TF3-DEVD-FMK储存液 或者 按1:100比例加入Annexin V-iFluor 488™（组分B）添加到每个孔中。
4.将细胞在37°C，5％CO2培养箱中孵育1小时。
注意：TF3-DEVD-FMK标记，细胞浓度可调整至~5×10⁶ cells/mL。贴壁细胞，使用0.5 mM EDTA温和消化细胞以保持完整性，标记前需用含血清培养基洗涤1次。具体孵育时间需根据细胞类型和浓度进行调整，建议每次实验前进行条件优化
贴壁细胞的膜联蛋白V流式检测非标准方案（细胞收获过程可能导致膜损伤）；贴壁细胞流式检测方法可参考Casiola-Rosen及van Engelend等建立的方案
5.如果需要，用DNA染料标记细胞（例如，整个细胞核染色，使用Hoechst，或者仅用Annexin V-iFluor 488™标记的死细胞，使用碘化丙啶）。
6.在约200g下离心细胞2分钟，并用1mL（或96孔板，则每孔200uL）洗涤缓冲液（成分E）洗涤细胞两次。将细胞重悬在所需的洗涤缓冲液量中。
注意：TF3-DEVD-FMK与Annexin V-iFluor 488™均为荧光标记物，需充分洗涤去除未结合试剂以降低背景干扰。 悬浮细胞应调整至2-5×10⁵ cells/100 µL（适用于微孔板检测）。
7.通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪监测荧光强度，具体参数如下：
TF3-DEVD-FMK 的激发波长 / 发射波长（Ex/Em）为 550/595 nm
膜联蛋白 V - iFluor 488™（Annexin V-iFluor 488™）为 490/525 nm
Hoechst 染色剂为 350/461 nm，
碘化丙啶（propidium iodide）为 535/635 nm。
流式细胞仪
FL1 通道监测 Annexin V-iFluor 488™的荧光强度
FL2 通道监测 TF3-DEVD-FMK 的荧光强度。圈选目标细胞群，排除细胞碎片。
荧光显微镜
将100 µL细胞悬液放入黑色96孔板的每个孔中。 在荧光显微镜下观察细胞，其中 TF3-DEVD-FMK 使用 TRITC 通道，Annexin V-iFluor 488™使用 FITC 通道（碘化丙啶染色使用 TRITC 通道，Hoechst 染色使用 DAPI 通道）
荧光酶标仪
将 100 µL 细胞悬液加入 96 孔黑色微量滴定板的每个孔中。使用荧光酶标仪（底部读数模式）监测荧光强度：Annexin V-iFluor 488™的激发波长 / 发射波长（Ex/Em）为 490/525 nm（截止波长 = 515 nm），和 / 或 TF3-DEVD-FMK 的激发波长 / 发射波长为 550/595 nm（截止波长 = 570 nm）
注意事项：
若需要平衡细胞浓度，可调整诱导组细胞的悬液体积，使其细胞密度接近未诱导组。如果细胞处理不会导致刺激组细胞数量大幅减少，此调整步骤可省略。
