Cell Meter 活细胞Caspase 3/7结合检测试剂盒 红色荧光

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产品优势

兼容荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪

适用范围

用于细胞凋亡检测

产品介绍

Cell Meter™活细胞半胱天冬酶活性检测试剂盒基于荧光标记的FMK半胱天冬酶抑制剂。这些抑制剂具有细胞膜通透性且无细胞毒性。进入细胞后，半胱天冬酶抑制剂会与活性半胱天冬酶发生共价结合。其中，caspase 3/7的激活对细胞凋亡的起始至关重要。研究证实，caspase 3/7对Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）肽序列具有特异性底物选择性。本试剂盒采用FAM-DEVD-FMK作为caspase 3/7活性的荧光指示剂，该标记物可不可逆地结合凋亡细胞中激活的caspase 3/7。结合后荧光试剂将被截留在细胞内，虽然会抑制caspase 3/7活性但不会阻断凋亡进程。

细胞凋亡可通过多种参数进行监测。Cell Meter™活细胞Caspase 3/7活性检测试剂盒专为通过检测活细胞中caspase 3/7的激活来测定细胞凋亡而设计，既可用于定量凋亡细胞中激活的caspase 3/7活性，也可用于筛选caspase 3/7抑制剂。红色荧光标记物FAM-DEVD-FMK支持通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪直接检测凋亡细胞中激活的caspase 3/7。试剂盒提供所有必需组分并附有优化后的实验方案。

适用仪器

分离细胞的检测方案

概述

1.用测试化合物制备细胞，密度为5×105至2×106个细胞/ mL

2.按 1:150 的比例向细胞溶液中加入 TF3-DEVD-FMK

3.室温孵育1小时

4.离心收集细胞，洗涤后用缓冲液或生长培养基重悬

5.荧光强度检测（底部读数模式）：Ex/Em=550/595 nm（截止波长570 nm）

荧光显微镜：使用TRITC滤光片

流式细胞仪：选用FL1通道

注：使用前将所有部件在室温下解冻。

储备溶液配制

除非另有说明，所有未使用的储备液应分装成单次使用量，制备后储存在 - 20°C。避免反复冻融。

TF3-DEVD-FMK 储备液（150X）：

向 TF3-DEVD-FMK（组分 A）的小瓶中加入 50 µL 二甲基亚砜（DMSO），配制 150X TF3-DEVD-FMK 储备液

有关细胞样品制备

请访问：https://www.aatbio.com/resources/guides/cell-sample-preparation.html

实验方案

1.根据特定的诱导方案培养细胞至适合凋亡诱导的密度，但不超过 2×10⁶个细胞 /mL。同时，对于每种标记条件，培养与诱导组密度相同的未诱导阴性对照细胞群。以下是一些诱导悬浮培养细胞凋亡的例子：

1）用2μg/ ml喜树碱处理Jurkat细胞3小时。

2）用1μM星形孢菌素处理Jurkat细胞3小时。

3）用4μg/ ml喜树碱处理HL-60细胞4小时。

4）用1μM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。

注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的细胞密度。

2.按 1:150 的比例向细胞溶液中加入 150X TF3-DEVD-FMK 储备液，将细胞置于 37°C、5% CO₂培养箱中孵育 1 小时。

注 a.用于 TF3-DEVD-FMK 标记的细胞可浓缩至约 5×10⁶个细胞 /mL。

    b.对于贴壁细胞，用 0.5 mM EDTA 轻轻吹打细胞以保持细胞完整，在与 TF3-DEVD-FMK 孵育前用含血清的培养基洗涤细胞一次。

    c.合适的孵育时间取决于所用的细胞类型和细胞浓度，需为每个实验优化孵育时间。

3.以约 200g 的离心力离心细胞 5 分钟，用 1 mL 洗涤缓冲液（组分 B）洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于适量的洗涤缓冲液中。

注1：TF3-DEVD-FMK 具有荧光，因此必须洗去所有未结合的试剂以消除背景干扰。对于悬浮细胞，应将细胞浓度调整为每块微量滴定板的每个孔中 2-5×10⁵个细胞 / 100 µL。

4.如果需要，可用DNA染色标记细胞（例如用 Nuclear Green™ DCS1 标记死细胞，或用 Hoechst 标记全细胞群的细胞核）

5.通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪监测荧光强度，参数如下：

TF3-DEVD-FMK：Ex/Em=550/595 nm

Nuclear Green™ DCS1：Ex/Em=490/525 nm

Hoechst 染料：Ex/Em=350/461 nm

流式细胞仪

使用 Ex/Em=550/595 nm 的通道监测荧光强度（Nuclear Green™ DCS1 染色使用 FL1 通道）。圈选目标细胞群，排除细胞碎片。

荧光显微镜

将 100 µL 细胞悬液加入 96 孔黑色微量滴定板的每个孔中。在荧光显微镜下观察细胞，其中 TF3-DEVD-FMK 使用 TRITC 通道（Nuclear Green™ DCS1 染色使用 FITC 通道，Hoechst 染色使用 DAPI 通道）。

荧光酶标仪

将 100 µL 细胞悬液加入 96 孔黑色微量滴定板的每个孔中。使用荧光酶标仪（底部读数模式）在 Ex/Em=550/595 nm（截止波长 = 570 nm）处监测荧光强度。

注意：若需要平衡细胞浓度，可调整诱导组细胞的悬液体积，使其细胞密度接近未诱导组。如果细胞处理不会导致刺激组细胞数量大幅减少，此调整步骤可省略。

试剂应用文献