磷酸盐检测试剂 MESG

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适用范围

用于磷酸盐检测

 

产品介绍

在无机磷酸盐存在条件下，MESG可经嘌呤核苷磷酸化酶（EC 2.4.2.1）催化转化为2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤，该转化反应伴随吸收波长红移现象。此特性已被应用于磷酸盐的分光光度法定量分析。我们现提供基于MESG的便捷式磷酸盐检测试剂盒（产品货号#21659）

 

常用储备液配制方法
表1. 溶解特定质量MESG磷酸盐检测试剂至目标浓度所需DMSO体积。请注意该体积仅用于配制储备液，具体实验请参照相关实验方案使用适当的实验/生理缓冲液。

0.1 mg	0.5 mg	1 mg	5 mg	10 mg
1 mM	319.142 µL	1.596 mL	3.191 mL	15.957 mL	31.914 mL
5 mM	63.828 µL	319.142 µL	638.284 µL	3.191 mL	6.383 mL
10 mM	31.914 µL	159.571 µL	319.142 µL	1.596 mL	3.191 mL

操作步骤

1.准备分析试剂：

1.1使用前在室温下解冻所有四种成分。

1.2准备 MESG 底物（组分 B）溶液：将 500 μL 的 ddH2O 添加到 MESG 底物（组分 B）的小瓶中。通过涡旋充分混合以获得 MESG 底物溶液

注意： 250μl足以使一个平板制成单独使用的等分试样并立即储存在-20°C。

1.3制备嘌呤核苷磷酸化酶（组分 C）溶液：将 100 μL ddH2O 添加到嘌呤核苷磷酸化酶（PNP；组分 C）的小瓶中。涡旋混匀，得到嘌呤核苷磷酸化酶溶液

1.4制备测定溶液：将全部体积的MESG底物溶液（来自步骤1.2）和嘌呤核苷磷酸化酶 溶液（来自步骤1.3）加入到测定缓冲液瓶（组分A）中，充分混合以得到测定溶液。将测定溶液置于冰上。

注1：该测定溶液在冰上稳定至少4小时。

注2：为达到理想的效果，需要紫外线透明板或比色皿。

注3：由于该测定对P i 的高灵敏度，使用无P i的实验室器皿非常重要

 

2. 准备连续稀释的磷酸盐标准品和/或测试样品：

2.1制备磷酸盐标准品： 将50μL1mMKH ₂ PO ₄（组分D）加入950μL去离子水或酶反应缓冲液中，得到50μM磷酸盐标准溶液。

2.250μM磷酸盐标准溶液200μL1：2系列稀释，得到25，12.5，6.25，3.125，1.56和0.78μM连续稀释的磷酸盐标准。

2.3根据表1和2，将含磷酸盐的测试样品和/或磷酸盐标准品加入透明的UV透明96孔微孔板中。

 

表1透明的UV透明96孔板中磷酸盐标准品和测试样品的方案

BL	BL	TS	TS	...
PS1	PS1	...	...	...
PS2	PS2
PS3	PS3
PS4	PS4
PS5	PS5
PS6	PS6
PS7	PS7

注意：PS =磷酸盐标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

表2每个孔的试剂组成

磷酸盐标准	空白	样本
连续稀释：50ul	不含磷酸盐的水或缓冲液：50ul	50ul

注意：将磷酸盐标准品的连续稀释液（0.1μM至50μM）加入PS1至PS7的孔中。

 

3.运行PhosphoWorks MESG磷酸盐测定：

3.1添加50μL/孔的测定溶液（来自S对 TEP 1.4） 中到的磷酸盐标准，空白对照和测试样品的孔中。彻底混合试剂。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL分析溶液。

3.2在室温下孵育30分钟。用酶标仪或分光光度计在360nm处监测吸光度。

注意：对于需要总体积大于100μL的比色皿测定，在测量吸收之前按比例增加样品和测定试剂的体积。