MycoLight 比率细菌膜电位试剂盒 红色/绿色荧光

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产品介绍

AAT Bioquest的MycoLight™比率型细菌膜电位检测试剂盒采用一种特殊荧光探针。该探针在低浓度时于革兰氏阳性菌和阴性菌内均呈现绿色荧光，但当胞内浓度升高（由膜电位增强引发染料分子聚集所致）时，荧光会向红色发射光谱偏移。

膜电位强度因菌种而异：对于多数革兰氏阳性菌，红/绿荧光比值的变化与质子梯度强度相关；而在许多革兰氏阴性菌中，染料响应与质子梯度强度未呈现明确比例关系。本试剂盒适用于细菌浓度在10⁵–10⁷ cells/mL范围内的膜电位检测。

经染色的细菌可通过488 nm（最常用激发光源）激发，并分别使用510-530 nm（FITC滤光片）和600-660 nm（Texas Red滤光片）通道进行荧光比率监测。

重要提示

实验前请将试剂盒组分置于室温解冻并短暂离心。

验证菌种说明

本试剂盒已在以下对数生长期细菌中通过测试：藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌。

技术注意事项

1.多数细菌对MycoStain It™ Green的响应与膜电位部分去极化程度不成比例，需针对具体菌株体系进行条件优化。

2.为获得好的膜电位检测效果，可能需调整MycoStain It™ Green的浓度及染色时间。

实验方案说明

以下为推荐的细菌染色步骤，该方案仅提供基础框架，请根据实际需求调整。

*特别注意：常见缓冲液成分（如Tween-20、叠氮化钠、硫柳汞）可能影响膜电位，应避免使用。在方法优化阶段需逐一验证添加剂对膜电位的影响。*

操作方法

1.在任何适当的培养基中培养细菌从对数期培养物中获得健康细菌的结果。用PBS缓冲液（组分C）或等效无菌缓冲液将菌液直接稀释至约10⁶ cells/mL（无需洗涤），每检测样本需准备500 µL菌悬液。

2.取500 µL菌悬液分装至流式管，每组实验设以下对照：去极化对照：添加10 µL 500 µM CCCP（组分B）；未染色对照：不添加染料

3.向各流式管（未染色对照除外）加入5 µL MycoStain It™ Green（100X，组分A），混匀后室温避光孵育30分钟。（5分钟后可检测，但信号强度在30分钟内持续增强）

4.使用488 nm激光的流式细胞仪检测，通过绿色（FITC滤光片）和红色（Texas Red滤光片）通道收集荧光信号。前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）及荧光信号均采用对数放大采集

5.使用未染色对照样本定位细菌群在FSC/SSC散点图中的位置。以SSC作为触发采集的参数

6.加载去极化对照样本，在FSC/SSC散点图中圈定细菌群，调节光电倍增管电压使红/绿荧光平均强度（MFI）值大致相等（无需设置补偿）

7.红绿荧光强度比可作为膜电位的大小无关性指标（尽管绝对强度受细胞尺寸和聚集影响）。也可在FSC/SSC圈门后，通过红-绿荧光散点图分析门内群体，以线性值（非通道数）记录MFI。

8.比率直方图：在目标峰周围设标记，记录平均比率值。散点图：在目标群体周围设区域，分别记录红/绿MFI值，通过红绿MFI比值评估膜电位。

9.流式检测仅依据细菌尺寸和染色性识别，建议通过荧光显微镜复核确认检测颗粒均为细菌。