PhosphoWorks 比色法MESG磷酸盐检测试剂盒 *UV吸收*

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产品优势

可定量溶液中浓度低至2 µM的磷酸盐

产品介绍

在无机磷酸盐存在下，MESG可经嘌呤核苷磷酸化酶（EC 2.4.2.1）催化转化为2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤，该转化过程伴随吸收波长红移。基于此特性，AAT Bioquest开发了MESG磷酸盐检测试剂盒。该试剂盒提供包括MESG、磷酸化酶及反应缓冲液在内的所有必需试剂。在pH 6.5-8.5条件下，MESG底物经磷酸解反应后在360 nm处吸光度增加；在pH 7.6时其消光系数变化值为11,000 M-1cm-1。本检测方法可定量溶液中浓度低至2 µM的磷酸盐，还可通过耦合双酶反应系统，用于监测磷酸酶（如GTP酶和ATP酶）的磷酸盐释放动力学过程。

样品实验方案

简要概述

1.运行激酶反应（20 µL）
2.添加ADP传感器缓冲液（20 µL）
3.添加ADP传感器（10 µL）
4.在室温下孵育15分钟-1小时
5.监控荧光强度

溶液制备 

1.标准溶液

磷酸盐标准
向950μL去离子水或酶反应缓冲液中添加50μL1 mM KH2PO4（组分D），得到50μM磷酸盐标准溶液（PS7）。 取50μM磷酸盐标准溶液，并进行1：2连续稀释，以用去离子水或酶反应缓冲液连续稀释磷酸盐标准液（PS6-PS1）。

2.工作溶液

2.1将500 µL ddH2O加入小瓶MESG底物（组分B）。 涡旋混合均匀，得到MESG底物溶液。 注意：250 µl足够一块板。

2.2向小瓶嘌呤核苷磷酸化酶（PNP；组分C）中加入100 µL ddH2O。 涡旋混合均匀，得到嘌呤核苷磷酸化酶溶液。

2.3将全部体积的MESG底物溶液和嘌呤核苷磷酸化酶溶液添加到分析缓冲液（组分A）的瓶子中，并充分混合以得到工作溶液。 将工作溶液放在冰上。 注意：此工作溶液在冰上至少可稳定4小时。 不建议将工作溶液冷冻进行其他测定。 为了获得理想的结果，需要紫外线透明的板或比色皿。 由于该测定法对Pi的敏感性很高，因此使用无Pi的实验室器具极为重要。

样品示例及操作

表1.黑色96孔微孔板中ADP标准品和测试样品的布局。 SD = ADP标准（SD1-SD7，0.05至30 uM）; BL =空白对照； TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成。

1.根据表1和表2提供的布局，准备磷酸盐标准品（PS），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 µL试剂代替50 µL。

2.将50 µL工作溶液添加到磷酸盐标准液，空白对照和测试样品的每个孔中，以使总测定体积为100 µL /孔。 彻底混合试剂。 对于384孔板，请向每个孔中添加25 µL工作溶液，总体积为50 µL /孔。

3.在室温下孵育30分钟。

4.用酶标仪或分光光度计在360 nm处监测吸光度。

注意：对于需要总体积大于100 µL的比色杯分析，在测量吸收之前，应按比例将样品和分析试剂的体积相乘。