pH荧光探针Protonex 红600, SE

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产品优势

特异性地检测细胞内的酸性区室，降低信号变异，提高成像和流式检测的准确性

 

适用范围

用于细胞pH值监测

 

产品介绍

Protonex™ Red染料具有pH依赖性荧光特性，与大多数在较高pH值下荧光更强的现有荧光染料不同，酸性条件会增强Protonex™ Red染料的荧光强度——当pH从中性降至酸性时，其荧光会显著增强。该染料在细胞外仅呈现微弱荧光，这一特性可能省去洗涤步骤，使其成为监测内体、溶酶体等酸性细胞区室的强大工具。

Protonex™ Red染料在细胞外荧光较弱，但在吞噬体、溶酶体和内体等酸性区室中荧光会大幅增强，从而能够以更低的信号变异性和更高的准确性特异性检测细胞酸性区室，适用于成像或流式应用；同时该染料还可与GFP、Fluo-8、钙黄绿素或FITC标记抗体等绿色荧光染料联用，进行多重细胞功能分析。Protonex™ Red的光谱特性与Texas Red相似，可直接使用Texas Red的通用滤光片组进行检测。

Protonex™ Red SE（琥珀酰亚胺酯衍生物）能便捷地制备各种生物偶联物，用于成像或流式分析，以更低的信号变异性和更高的准确性特异性检测吞噬作用和内吞作用；这些偶联物同样适用于与上述绿色荧光染料联用进行多重细胞功能分析。由于Protonex™ Red具有与Texas Red相似的光谱特性，其检测可直接采用Texas Red的通用滤光片组。

操作步骤

（除非另有说明，所有未使用的储存液应在配制后分装成单次使用量，并于-20°C保存。避免反复冻融。）

蛋白储存液（溶液A）

将100 µL反应缓冲液（如1M碳酸钠溶液或pH~9.0的1M磷酸盐缓冲液）与900 µL目标蛋白溶液（如抗体，蛋白浓度建议>2 mg/mL）混合，配制1 mL蛋白标记储存液。

注意事项：1.蛋白溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。若pH低于8.0，需使用1M碳酸氢钠溶液或pH 9.0的1M磷酸盐缓冲液调节至8.0-9.0范围。 

                 2.蛋白应溶解于1X磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2-7.4）中。若蛋白溶解于Tris或甘氨酸缓冲液，必须用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析以去除游离胺类或铵盐（如硫酸铵、醋酸铵等蛋白沉淀常用试剂）。

                 3.含杂质抗体或用牛血清白蛋白（BSA）、明胶稳定的抗体标记效果不佳。叠氮化钠或硫柳汞可能干扰偶联反应，建议通过透析或离心柱去除以获得最佳标记效果。

                 4.蛋白浓度低于2 mg/mL会显著降低偶联效率，推荐最终蛋白浓度为2-10 mg/mL。

Protonex™ Green 600, SE储存液（溶液B）

向Protonex™ Green 600, SE瓶中加入无水DMSO，配制10 mM储存液，通过移液或涡旋混匀。

注意事项：1.溶液B需在偶联反应前新鲜配制并立即使用。长期储存可能导致染料活性下降。 

                  2.避光防潮条件下，溶液B可于冷冻保存两周，但需避免反复冻融。

 

实验操作流程样本

本操作方案专为Protonex™ Green 600, SE与山羊抗小鼠IgG的偶联反应而设计。针对其他特定蛋白可能需另行优化。

注意： 每种蛋白所需染料/蛋白比例各异，该比例还取决于染料特性。过量标记会损害蛋白结合活性，而标记比例过低则会导致检测灵敏度下降。

进行偶联反应

1.建议以10:1摩尔比（溶液B染料/溶液A蛋白），取95 µL蛋白溶液（溶液A，假设蛋白浓度为10 mg/mL，分子量~200 KD，则蛋白浓度约0.05 mM）加入5 µL染料储存液（溶液B，10 mM），充分振荡混匀

若10:1比例效果不佳，可测试5:1、15:1及20:1等不同比例以确定最佳标记条件。

2.室温下持续旋转或振荡反应混合物30-60分钟。

 

偶联物纯化

以下为使用Sephadex G-25层析柱纯化的标准流程

1.按制造商说明预处理Sephadex G-25层析柱。

2.将偶联反应液（来自"进行偶联反应"步骤）

3.当样品液面刚好降至柱料顶层下方时，立即加入PBS缓冲液（pH 7.2-7.4），继续加入PBS缓冲液（pH 7.2-7.4）直至目标样品完全洗脱

4.收集含目标染料-蛋白偶联物的组分

保存说明

短期使用：偶联物需用染色缓冲液稀释后分装，避免反复冻融

长期保存：建议浓缩或冻干处理