RatioWorks BCFL,AM*BCECF的代替品*

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产品优势

不受染料浓度、光程长度、细胞渗漏以及光漂白速率等多种变量因素的影响。

 

适用范围

用于细胞pH监测

 

产品介绍

细胞内pH值作为关键调控因子，在细胞生长、钙离子调节、酶活性、受体介导的信号转导、离子转运、内吞作用、趋化运动及细胞黏附等多种生理过程中发挥着重要作用。近年来，pH敏感荧光染料已成为监测细胞内pH变化的常用工具。相比微电极等传统技术，荧光pH指示剂成像技术能提供更高的空间分辨率和采样密度。

其中，2',7'-双(2-羧乙基)-5(6)-羧基荧光素(BCECF)因其比率法检测特性成为最常用的pH探针。然而，市售BCECF AM均为至少三种异构体的混合物，且不同批次异构体比例存在差异，影响了BCECF的应用效果。

为解决BCECF AM的异构体问题，研究人员开发了BCFL探针。与BCECF类似，BCFL同样具有pH依赖的双激发特性，其pKa值约为7.0。BCFL在454nm处具有等吸收点的双激发光谱，使其成为优异的激发比率法pH指示剂。BCFL比率成像技术不受染料浓度、光程、细胞渗漏和光漂白率等变量的影响。BCFL AM为单一异构体，相比含多种异构体的BCECF AM，其pH测量结果具有更好的可重复性。

实验方案

储备液配制

（注意事项：若无特殊说明，所有未使用的储备液均应分装为单次使用量，配制完成后保存于-20°C，避免反复冻融。）

RatioWorks™ BCFL AM储备液

使用高纯度无水DMSO配制10-20 mM的RatioWorks™ BCFL AM储备液。

注：溶解于DMSO后，RatioWorks™ BCFL AM应为无色透明溶液。

 

工作液配制

RatioWorks™ BCFL AM工作液

实验当天，将RatioWorks™ BCFL AM溶解于DMSO或取适量储备液恢复至室温。使用选定缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）配制5-50 μM的工作液。

注意：1.使用非离子型表面活性剂Pluronic® F-127提高AM酯的水溶性，染色缓冲液中Pluronic® F-127终浓度建议为0.02%（百萤生物提供多种Pluronic® F-127产品）。

           2.若细胞存在有机阴离子转运体，可在工作液中加入1-2 mM丙磺舒（孔内终浓度0.5-1 mM）以减少去酯化探针的渗漏（百萤生物提供多种ReadiUse™丙磺舒产品，包括水溶性钠盐和稳定溶液等）。

 

实验操作流程

（以下为哺乳动物活细胞加载RatioWorks™ BCFL AM的推荐方案，请根据实际需求调整。）

1.按实验要求制备活性细胞。

2.次日，向细胞板中加入RatioWorks™ BCFL AM工作液（96孔板：100 μL/孔；384孔板：25 μL/孔）。

注意：若待测化合物与血清存在干扰，需在染料加载前用新鲜HHBS缓冲液替换生长培养基（96孔板：100 μL/孔；384孔板：25 μL/孔）。

3.将加载染料的细胞板置于37°C培养箱中孵育30-60分钟。

4.使用HHBS或选定缓冲液替换染料工作液，去除多余染料。

5.使用HHBS或选定缓冲液制备化合物板（96孔板：50 μL/孔；384孔板：25 μL/孔）。

6.进行pH检测，并同步选用以下任一方式进行荧光监测：

配备FITC滤光片组的荧光显微镜 

荧光酶标仪（激发/发射波长=490/535 nm，截止波长515 nm）

 

比率法检测需同步监测：

激发/发射1=430/535 nm（截止515 nm）

激发/发射2=505/535 nm（截止515 nm）

 

试剂应用文献

Single-Cell Analysis with Spatiotemporal Control of Local pH
Authors: Cremin, Kelsey and Meloni, Gabriel N and Soyer, Orkun S and Unwin, Patrick R
Journal: ACS Measurement Science Au (2025)