RatioWorks PDMPO, SE 标记反应染料

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产品优势

1.在低pH条件下发射强黄色荧光，高pH环境呈现强蓝色荧光，其pKa值为4.47，匹配酸性细胞器的检测需求

2.大斯托克斯位移和好的光稳定性

 

适用范围

细胞pH值检测

 

产品介绍

现有pH荧光探针（如BCECF、SNARF等）由于在低pH环境下荧光信号显著衰减，难以有效应用于溶酶体、内吞体、吞噬体、精子细胞及顶体等酸性细胞器的研究，这也导致比率成像技术虽经数十年发展却因缺乏合适探针而应用受限。

RatioWorks™ PDMPO作为一款pKa=4.47的酸性双激发/双发射pH探针，在低pH时发射强黄色荧光（~550nm）、高pH时呈现强蓝色荧光（~450nm），其大斯托克斯位移和好的光稳定性使其成为荧光成像与流式检测的理想试剂；该探针不仅可通过405nm紫激光激发用于活细胞内吞/吞噬作用及酸性细胞器研究，其琥珀酰亚胺酯（SE）形式更能便捷制备多种生物偶联物，在与GFP、Fluo-8、钙黄绿素或FITC标记抗体等绿色荧光染料进行多重检测时，可显著降低信号变异度并提高检测准确性，同时兼容Pacific Blue/Pacific Orange常规滤光片系统。

储备溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分装成单次使用量，于-20°C保存，并避免反复冻融。

1. 蛋白储备液（溶液A）

取100 µL反应缓冲液（如1M碳酸钠溶液或pH~9.0的1M磷酸盐缓冲液）与900 µL目标蛋白溶液（如抗体，建议蛋白浓度>2 mg/mL）混合，配制1 mL蛋白标记储备液。

注意：1.溶液A的pH值应维持在8.5±0.5。若pH低于8.0，需用1M碳酸氢钠溶液或1M pH9.0磷酸盐缓冲液调节至8.0-9.0范围

          2.必须使用pH7.2-7.4的1X PBS缓冲液溶解。若原溶于Tris或甘氨酸缓冲液，需先透析去除游离胺基或铵盐（如硫酸铵、醋酸铵等蛋白沉淀剂）

          3.含BSA或明胶的抗体、不纯抗体标记效果差。叠氮化钠或硫柳汞可能干扰偶联反应，建议通过透析或离心柱去除

          4.蛋白浓度低于2 mg/mL会显著降低偶联效率，推荐使用2-10 mg/mL终浓度

 

RatioWorks™ PDMPO SE储备液（溶液B）

向RatioWorks™ PDMPO SE瓶中加入无水DMSO，配制10 mM储备液，通过移液或涡旋混匀。

注意：需在偶联反应开始前新鲜配制，现配现用，避光防潮条件下可冷冻保存两周，避免反复冻融，长期储存会导致染料活性下降

 

实验操作流程

（本方案以山羊抗小鼠IgG与RatioWorks™ PDMPO SE的偶联为例，实际应用中需根据特定蛋白特性进行优化）

偶联反应步骤

1.以染料（溶液B）:蛋白（溶液A）= 10:1 的摩尔比为起始条件，取5 µL染料储备液（溶液B，10 mM）加入95 µL蛋白溶液（溶液A）中，充分混匀。（（蛋白浓度按10mg/mL、分子量~200kDa计算时，蛋白溶液浓度约为0.05mM））

建议：若10:1比例效果不佳，可测试5:1、15:1或20:1等不同比例

2.室温下持续旋转或振荡混合液 30-60分钟

 

纯化流程

（以Sephadex G-25柱纯化为例）

1.按说明书预处理Sephadex G-25层析柱

2.将偶联反应液上样至柱顶层

3.当样品液面降至柱料表层时，立即加入PBS缓冲液（pH 7.2-7.4）

4.继续用PBS洗脱至目标组分完全流出，收集含染料-蛋白偶联物的馏分

注意： 短期使用：用染色缓冲液稀释后分装

           长期保存：建议浓缩或冻干处理