这些简单易用的一氧化氮检测试剂 你了解吗？

 

        一氧化氮（NO）自由基是参与许多生理和病理过程的重要细胞信号分子。它是一种重要的生物调节剂，是神经科学，生理学和免疫学领域的基本组成部分。一氧化氮是一种强大的血管扩张剂，血液中的半衰期很短，只有几秒钟。在一个多世纪前，就发现了诸如硝化甘油和亚硝酸戊酯等久负盛名的药物，它们通过作为一氧化氮前体的机制而具有活性。低水平的一氧化氮产生对于保护器官（例如肝脏免受缺血性损伤）很重要。

 

DAX-J2 NO检测探头的主要特点：

NO检测不需要酯酶活性。

不受pH影响的光谱特性。

比DAF-2更容易拍照。

对细胞培养基水解的耐受性高于DAF-2。

与GFP细胞系或使用FITC标记抗体进行多色细胞分析的应用相容。

 

        DAF-2试剂经常用于检测一氧化氮（NO）。然而，DAF-2二乙酸酯在细胞培养基中自发水解。水解的DAF-2具有细胞不可渗透性，因此导致高的测定背景。DAX-J2 探针是DAF-2的优异替代品，用于NO的检测和生物成像。与DAF-2试剂相比，DAX-J2 试剂具有更长的波长和更好的稳定性。AAT Bioquest提供三种不同的DAX-J2 多色成像试剂，用于NO检测。

        DAX-J2 Red（Cat＃16301）是一种非荧光细胞渗透试剂，可以在生理条件下测量活细胞中的游离NO和一氧化氮合酶（NOS）活性。一旦进入细胞内，DAX-J2 试剂上的封闭基团就会释放，在NO氧化时产生高度红色的荧光产物。DAX-J2 荧光产品可以使用大多数配备Texas Red^®过滤器的流式细胞仪和荧光显微镜进行检测。

 

图1. DAX-J2 试剂的光谱特性。在PBS缓冲液（pH7.2）中的DAF-2（绿色），DAX-J2 橙（橙色，Cat＃16300），红色（红色，Cat＃16301）和IR（深红色，Cat＃16302）。 

 

        DAX-J2 橙色（cat#16300）生一种亮橙色荧光，其光谱特性成与Cy3^® 和TRITC类似。DAX-J2 橙色可以很容易地进入到活细胞中，它的荧光信号可以用Cy3^®/ TRITC滤波器组方便地监测 。

图 2.DAX 缓冲液（pH7.2）中DAX-J2 橙（5μM，Cat＃16300）对不同活性氧（1mM）的荧光响应。在Ex / Em = 540 / 570nm下测量荧光强度。 

 

        DAX-J2 IR（Cat＃16302）是一近红外荧光的新型荧光NO传感器。DAX-J2 IR试剂具有高度水溶性。它使得能够使用IVIS^®成像系统（PerkinElmer）在体内进行NO检测。

        DAX-J2 比率580/460（Cat＃16310）AAT Bioquest开发的新型一氧化氮（NO）传感器。它是一种细胞渗透性试剂，能以比例计量方式测量活细胞中的游离一氧化氮合酶（NOS）活性。一旦进入细胞内，DAX-J2 试剂上的阻断基团被释放，在没有氧化的情况下，在波长580 nm和460 nm处诱导荧光比变化。可以使用Cy3®/ TRITC和BD Horizon V450 / Pacific Blue的过滤器组检测580 nm和460 nm的荧光强度。大多数流式细胞仪和荧光显微镜都配有这两种滤光片组。

图   3.DAX-J2 比率580/460（2μM，Cat＃16310）对PBS缓冲液（pH = 7.2）中的不同活性氧物质（1mM）的荧光响应。分别在580nm和460nm下测量荧光强度。 

 

与常用的DAF-2 NO探针相比，DAX-J2 比率580/460具有明显的NO检测优势：

1.DAX-J2 比率580/460不需要酯酶活性进行NO检测。DAF-2需要细胞内酯酶切割其乙酸酯基团以检测NO活性。

2.DAX-J2 产品具有不依赖pH的荧光，而DAF-2的荧光则受pH的影响很大。

3.DAX-J2 Ratio 580/460可以在比率模式下进行监控。

 

表1.多色一氧化氮（NO）探针

        改变的NO的产生与各种免疫，心血管，神经变性和炎性疾病有关。作为自由基，NO作为自由基，氧化速度快，浓度相对较低。Cell Meter 荧光细胞内一氧化氮测定试剂盒提供了一种强大的工具来监测活细胞中的细胞内NO水平。

        Nitrixyte Orange和Nitrixyte Red是DAF-2检测和成像细胞内游离NO的替代品。与广泛使用的DAF-2探针相比，Nitrixyte Orange和Nitrixyte Red具有更好的光稳定性和增强的细胞渗透性。Cell Meter 荧光细胞内一氧化氮测定试剂盒（Cat＃16350和16351）使用Nitrixyte Orange与NO反应生成亮橙色荧光产品。Nitrixyte 橙色的NO产生的产品具有类似于Cy3^®和TRITC的光谱特性。Nitrixyte 橙色可以很容易地进入活细胞，，并且可以使用cy3®或tritc的滤波器组方便地监测其荧光信号。Kit 16350针对荧光成像和酶标仪应用进行了优化。Kit 16351针对流式细胞仪应用进行了优化。 

 

图4.使用Cell Meter 荧光细胞内一氧化氮测定试剂盒（Cat＃16350）在DEA NONOate处理（NO供体）下检测细胞中的外源一氧化氮（NO ）。将CHO-K1和HeLa细胞以50,000个细胞/孔/100μL接种在96孔黑色壁/透明底板中过夜。将细胞与Nitrixyte Orange工作溶液在37℃下孵育30分钟。用或不用1mM DEA NONOate在37℃下处理细胞30分钟。在底部读取模式下在Ex / Em = 540 / 590nm（在570nm处截止）监测荧光信号。

 

        Cell Meter 荧光细胞内一氧化氮检测试剂盒（cat#16356）使用Nitrixyte Red与NO反应生成亮红色荧光产品。Nitrixyte 红色的NO生成荧光产物具有类似于Texas Red®.的光谱特性。Nitrixyte Red可以很容易地加载到活细胞中，使用Texas Red®.过滤器可以方便地监测其荧光信号。Kit 16356针对流式细胞仪应用进行了优化。

 

图5.使用Cell Meter 荧光细胞内一氧化氮测定试剂盒（Cat＃16350）在RAW 264.7巨噬细胞中测量内源性一氧化氮（NO）的荧光图像。将原始264.7细胞以100,000个细胞/孔/100μL接种在96孔黑色壁/透明底板中过夜。将细胞与Nitrixyte Orange一起孵育，并在37℃下用（右）或不用（左）20μg/ mL脂多糖（LPS）和1mM L-精氨酸（L-Arg）处理16小时。使用具有TRITC过滤器的荧光显微镜测量荧光信号。 

 

图6.使用Cell Meter 荧光细胞内一氧化氮测定试剂盒（Cat＃16351）在DEA NONOate处理（NO供体）后检测Jurkat细胞中的外源一氧化氮（NO ）。将细胞与Nitrixyte Orange在37℃下孵育30分钟，并用测定缓冲液洗涤两次。将细胞用（红色）或不用（蓝色）1mM DEA NONOate在37℃处理30分钟。在FL2通道中监测荧光信号。

 

图7.使用Cell Meter 荧光细胞内一氧化氮活性测定试剂盒（Cat＃16356）在DEA NONOate处理（NO供体）后检测Jurkat细胞中的外源一氧化氮（NO ）。将细胞与Nitrixyte Red在37℃下孵育30分钟。将细胞用（红色）或不用（蓝色）1mM DEA NONOate在37℃处理2小时。使用流式细胞仪（BD FACSCalibur ）在FL4通道中监测荧光信号。

 

表2.细胞内一氧化氮（NO）测定试剂盒

        百萤生物是 AAT Bioquest 中国区域一级代理商，为国内提供 AAT 的原装产品及产品定制、技术服务，欢迎咨询、订购！