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肌动蛋白(Actin)

 

F肌动蛋白丝成像探针

肌动蛋白是形成微丝的蛋白质家族。 由于它在真核细胞中的细胞内丰度,在微摩尔浓度范围内,所以肌动蛋是参与最多蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白。 鬼笔环肽的荧光衍生物已被证明在固定细胞和组织中的肌动蛋白丝以及在体外可视化单个肌动蛋白丝方面非常有用。荧光鬼笔环肽衍生物已经成为研究肌动蛋白骨架的重要工具。

 

肌动蛋白

肌动蛋白是形成微丝高度保守的蛋白质家族。在从酵母到高等真核生物(如人)之间,其氨基酸序列变化小于20%。由于其在真核细胞中的细胞内丰度很高,在微摩尔浓度之内,因此肌动蛋白对蛋白与蛋白的相互作用的参与率最高。它具有从单体状态动态聚合成丝状肌动蛋白(F-actin)的独特能力。F-肌动蛋白与调节蛋白(例如肌动蛋白结合蛋白)之间的相互作用会迅速组装和拆卸肌动蛋白丝,将它们组织成肌动蛋白束和细胞骨架网络。这些高阶结构为许多细胞过程提供了必要的机械和结构支持,包括细胞内转运,胞质分裂,细胞运动,极性和细胞形状,基因调控和信号转导。由于肌动蛋白在许多生物学过程中必不可少,因此研究这些肌动蛋白结构的工具(肌动蛋白特异性抗体和鬼笔环肽衍生的染色剂)必不可少。

 

检测丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)

F-肌动蛋白染色通常用于表征细胞骨架的结构和功能。由于肌动蛋白细胞骨架是活细胞中非常动态且不稳定的结构,因此在标记肌动蛋白之前通常需要冷甲醇或多聚甲醛固定。在固定细胞中,肌动蛋白结构可以通过肌动蛋白抗体、荧光鬼笔环肽或电子显微镜观察。抗体识别单体和聚合物(丝状或 F-肌动蛋白)肌动蛋白,因此与仅结合 F-肌动蛋白的探针相比,往往具有较高的背景。 

图1. 荧光合成图像。活的 HeLa 细胞用线粒体染料 MitoLite Green EX488(货号 22675)染色并成像。 在 4% 甲醛中固定后,细胞用 F-肌动蛋白探针 Phalloidin-iFluor 633 Phalloidin(货号 23125)和核复染剂核蓝 DCS1(货号 17548)染色。

 

鬼笔环肽

鬼笔环肽是鬼笔毒素家族的主要代表,是一种从有毒的死帽蘑菇中分离出的双环七肽。 与单体 G-肌动蛋白相比,它对 F-肌动蛋白亚基之间的凹槽具有高结合亲和力。与肌动蛋白抗体相比,鬼笔环肽的非特异性结合可以忽略不计,从而在细胞成像过程中提供最小的背景和高对比度。 一旦与 F-肌动蛋白结合,鬼笔环肽将单体和细丝的平衡向细丝位置移动,并抑制 ATP 水解。这种相互作用通过防止亚基解离来稳定肌动蛋白丝,并通过降低临界浓度促进肌动蛋白聚合。因此,这些特征使鬼笔环肽衍生物成为可视化 F-肌动蛋白和细胞骨架网络的有用染色剂。

鬼笔环肽的化学结构* CAS#:17466-45-4 *(货号5301)。

鬼笔环肽是鬼笔毒素家族的主要代表,是一种双环七肽,从有毒的死亡帽蘑菇伞形毒蕈中分离出来。它对F-肌动蛋白亚基之间的凹槽比单体G-肌动蛋白更具有亲和力。一旦与F-肌动蛋白结合,鬼笔环肽就会使单体和长丝的平衡向长丝位置移动,并抑制ATP水解。相互作用通过防止亚基解离来稳定肌动蛋白丝,并通过降低临界浓度促进肌动蛋白聚合。结果,这些特性使得鬼笔环肽衍生物成为可视化F-肌动蛋白和细胞骨架网络的经典染色剂。

 

选择正确的鬼笔环肽衍生物

1.未标记的鬼笔环肽: 未标记的鬼笔环肽用途有限。除了用作肌动蛋白聚合的促进剂外,未标记的鬼笔环肽通常用作阻断F-肌动蛋白染色的对照。

2.生物素化鬼笔环肽: 生物素化的鬼笔环肽提供了一种可视化和定量肌动蛋白丝的间接方法。它需要使用荧光或酶结合的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素进行可视化操作。虽然间接检测具有信号放大的优势,但对其他试剂的需求却增加了成本和测定时间。另外,当用生物素化的鬼笔环肽染色时,需要更高浓度的鬼笔环肽缀合物,大约是荧光鬼笔环肽的两倍。虽然有缺点,但生物素化的鬼笔环肽都适合用于pull-down实验和免疫沉淀分析,用以研究蛋白质相互作用以及F-肌动蛋白的共定位等。

3.荧光鬼笔环肽-iFluor 缀合物: 利用我们的iFluor 染料出色的荧光特性,AAT Bioquest开发了一系列覆盖整个色谱的鬼笔环肽缀合物,它们选择性地与F-肌动蛋白结合。这些iFluor 鬼笔环肽衍生物以纳摩尔浓度使用,可方便用于许多肌动蛋白相关的测定。此类测定包括标记、鉴定和定量用甲醛固定和透化的组织切片中的F-肌动蛋白,细胞培养或无细胞实验。与传统的异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明缀合物相比,鬼笔环肽-iFluor 缀合物具更高的荧光强度和光稳定性。鬼笔环肽-iFluor 700、iFluor -750和iFluor -790缀合物是少数几种可用的近红外染料,可与常用的红色荧光团进行光谱分离。

 

iFluor 标记的鬼笔环肽系列

iFluor 系列产品是美国AAT Bioquest 自主研发的全光谱覆盖的荧光染料。它可以与赛默飞的AlexaFluor系列产品媲美,并在大多数情况下荧光、信号、背景等方面都要优于AlexaFluor系列产品。iFluor标记的鬼笔环肽可以标记、识别和定量甲醛固定和透化的组织切片、细胞培养物或无细胞实验中的 F-肌动蛋白。

iFluor 标记的鬼笔环肽详情
应用范围 肌动蛋白微丝(F-actin)的荧光成像
适用的细胞/组织 固定和透化细胞、细胞培养、无细胞实验、甲醛固定和透化组织切片
染色位置 F-肌动蛋白(不与单体G肌动蛋白结合)
活细胞/固定细胞 仅适用于固定细胞
是否可穿过细胞膜 不能
是否可进行多路复用 可以
适用平台 荧光显微镜和其他成像平台

图示:A)用鬼笔环肽-iFluor 488染色(货号23115)染色的HeLa细胞的荧光图像,并使用配备FITC滤光片的荧光显微镜观察。将细胞固定在4%甲醛中,并与线粒体染料MitoLite Red FX600(货号22677)和Nuclear Blue DCS1(货号17548)染色;B)用鬼笔环肽-iFluor 514(货号23116)染色的HeLa细胞的荧光图像,并使用配备有TRITC滤光片组的荧光显微镜观察。固定的细胞用Nuclear Blue DCS1(货号17548)染色;C)用鬼笔环肽-iFluor 532(货号23117)染色的HeLa细胞的荧光图像,并使用配有TRITC滤光片组的荧光显微镜观察。固定的细胞用Nuclear Green DCS1(货号17550)染色;D)用鬼笔环肽-iFluor 647(货号23127)染色的HeLa细胞的荧光图像,并使用配备Cy5滤光片组的荧光显微镜观察。首先用线粒体染料MitoLite Green(货号22675)对活细胞进行染色。在4%甲醛中固定后,细胞用鬼笔环肽-iFluor 647标记,并用Nuclear Blue DCS1(蓝色,货号17548)染色。

表1:iFluor 鬼笔环肽系列产品

品牌 名称 货号 规格 Ex/Em(nm) 溶剂
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 350标记 #23110 300 Tests 345/450 DMSO
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 405标记 #23111 300 Tests 403/429 DMSO
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 488标记 #23115 300 Tests 491/516 DMSO
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 514标记 #23116 300 Tests 528/555 DMSO
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 532标记 #23117 300 Tests 537/560 DMOS
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 555标记 #23119 300 Tests 557/570 DMSO
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 594标记 #23122 300 Tests 588/604 DMSO
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 633标记 #23125 300 Tests 640/654 DMSO
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 647标记 #23127 300 Tests 656/670 DMSO
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 680标记 #23128 300 Tests 684/701 DMSO
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 700标记 #23129 300 Tests 690/713 DMSO
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 750标记 #23130 300 Tests 757/779 DMSO
AAT Bioquest 鬼笔环肽-iFluor 790标记 #23131 300 Tests 787/812 DMSO

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