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百萤问号:Western Blot 常见问题解答

样品的常见问题

1.1 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot (以下简写成Western Blot),提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂),开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?

解答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查Western Blot过程, 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

 

1.2 细胞水平要做Western Blot,多少细胞提的蛋白够Western Blot?

解答:一般地5 x 106就足够了。

 

1.3 同一样品能同时提RNA又提蛋白吗,这样对Western Blot有无影响?

解答:能,没有问题,我们做过。

 

1.4 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗?

解答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。

 

1.5 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?

解答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

 

1.6 我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?

解答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,多加5-10%甲醇。

 

1.7 想分离的蛋白是分子量260kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗?

解答:260kd的蛋白不好做, 分离胶用6%, Stacking Gel 3.5%。

 

1.8 如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。

解答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5mm的 comb。

 

1.9 蛋白变性后可以存放多久?

解答:-80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

 

1.10 我所测定的蛋白分子量是105KD,按理说分离胶应当采用7.5%,但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方,不知为何?

解答:上述您提到的两种凝胶均可以使用,因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意条带位置。

 

1.11 一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?

解 答:Western Blot一般上样30-100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳 性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适 合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。

 

1.12 做组织样品的western的时候,处理样品有什么诀窍吗?还有,您用过大牛血清做封闭剂吗?浓度如何?效果是不是比BSA好一点?

解答:必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制剂 cocktail),封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体,使用BSA也是不错的选择。

 

1.13 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?

解答:做200kd蛋白的Western Blot时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。

 

1.14 有什么方法可以提高上样量?

解答:可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量。

 

1.15 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白,膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机,有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法,42kd的蛋白分子量算不算大?

解答:如是需要提取膜蛋白,(而不是只需要提取膜蛋白),可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白,用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大,也不算小,所以,可以按照一般的转移方法实施。

 

1.16 蛋白的上样量有没有什么具体的要求?

解答:上样量要根据实验的要求来定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等, 如果只是要定性,则没有太大的关系, 尽量多上就行了, 但是不要超过0.3μg/mm2。

 

1.17 一抗,二抗的比例是否重要?

解答:比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。


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