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AAT 最新研发:Transfectamine 5000转染试剂操作建议

 

 

      Transfectamine 5000转染试剂是美国AAT Bioquest生产的转染试剂,Transfectamine 5000转染试剂是一种功能强大且用途广泛的转染试剂,可将核酸引入真核细胞,引入动物细胞。它可以有效地将各种有效载荷转染到各种粘附和悬浮细胞系中。它可用于质粒DNA转染以及基于siRNA和shRNA的基因敲低实验和基因表达研究。它在包括难于转染的细胞在内的各种贴壁和悬浮细胞系中始终提供高转染效率。Transfectamine 5000的低毒性也使转染细胞具有更高的生存能力。与大多数其他转染试剂相比,Transfectamine 5000更易于使用,并且不需要特殊的介质。

图1.使用Transfectamine 5000,Lipofectamine 2000和Lipofectamine 3000试剂在HeLa细胞中的转染效率比较。 每种试剂用于以96孔格式转染HeLa细胞,转染后24小时分析GFP表达。 与Lipofectamine 2000和Lipofectamine 3000试剂相比,Transfectamine 5000转染试剂可提供更高的GFP转染效率。

 

细胞脂质转染机制

      细胞脂转染,有时也称为“脂质转染”,是利用脂质复合物通过内吞作用或融合作用将核酸或蛋白质输送到细胞中的方法。 由于程序效率会因细胞系,生物有效载荷细胞毒性和其他因素而有很大差异,因此有必要进行大量优化。

 

脂质转染过程建议

1.细胞系优化

1.1 确定细胞系转染抗性

1.2 建议查看旧版的操作方案,因为它含有更多细胞系兼容性的内容

1.3 悬浮细胞通常需要比贴壁培养更高的密度

 

2.DNA的纯度与质量

2.1 DNA纯度和质量比较DNA /试剂浓度以获得最佳性能

2.2 细胞混合前测试DNA和试剂的不同孵育时间

2.3 内毒素水平应保持尽可能低

2.4 1.7-1.9的A260 / A280是大多数程序的理想纯度

 

3.细胞融合与健康

3.1初步的细胞活力测定以确定细胞健康

3.2建议将大多数细胞系汇合至70-90%

3.3减少所需试剂以保持低毒性

3.4实验前24小时准备细胞培养以达到最佳状态

 

操作步骤

1.准备细胞进行转染 培养细胞至约90%融合并使用新鲜,干净的生长培养基

2.准备Transfectamine 5000-DNA混合物

2.1首先将2.5 ug DNA与200 uL无血清培养基混合。

2.2将7.5 uL解冻的Transfectamine 5000添加到DNA /培养基混合物中。

2.3充分混合并在室温下孵育20分钟。

3.将Transfectamine 5000-DNA混合物添加到细胞培养物中

4.过夜培养

5.用适当的方法分析转染效率

5.1转染后72-96小时可识别最大表达水平

5.2如果使用流式细胞仪,激光扫描分子成像,显微镜或蛋白质印迹分析,则建议使用荧光标记

 

常见问题

1.死细胞/不健康细胞解决方案

1.1在不使用试剂的情况下对DNA进行额外的控制:表达的蛋白质可能具有毒性

1.2检查是否有污染并根据需要进行处理,或者使用新的培养液进行实验

1.3选择抗生素可能太强或添加太早。 以更低的浓度和更长的间隔再次测试

 

2.转染料率低解决方案

2.1试剂可能没有正确存储。 检查以确保没有发生意外的重新冻结

2.2DNA质量或数量可能不足。 根据经验确定合适的脂质与DNA的比例

2.3细胞培养基可能被血清或抗生素污染。 确保培养基不含生长促进剂或其他添加剂

 

用流式细胞仪确定转染效率

1.使用未转染的对照,并从实验结果中减去基线强度数据

2.信号强度图是比较细胞系对不同转染试剂反应的简单视觉辅助工具

3.许多仪器都有带有FACS分析程序的软件,可快速获得结果