AATOM 488 NHS酯
| Ex (nm) | 499 | Em (nm) | 520 |
| 分子量 | 787.86 | 溶剂 | DMSO |
| 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
产品货期
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产品优势
AATOM™ 488 NHS 酯 是一种可与氨基发生反应的绿色荧光染料，其激发/发射波长为 499/520 nm，适用于流式细胞术（FACS）和荧光原位杂交（FISH）等应用。
快速氨基偶联： 可与多肽上的伯氨基、氨基修饰的寡核苷酸及表面氨基硅烷快速形成稳定的酰胺键
高量子产率与高光稳定性： 提供强烈且持久的荧光信号
中等亲水性： 保持良好的溶解性，同时避免过度疏水相互作用
适用范围
标记蛋白质、胺修饰寡核苷酸和其他含胺分子
产品介绍
AATOM™ 488是一种亲水性、罗丹明结构的荧光染料，具有好的水溶性。其特性包括强吸收性、高荧光量子产率和卓越的光稳定性，因此非常适用于高级荧光成像技术。该染料的激发波长范围为480-515 nm，与氩离子激光器的488 nm发射谱线高度匹配。AATOM™ 488尤其适用于单分子检测及超分辨率显微技术，如PALM、dSTORM和STED。此外，该染料也适用于流式细胞术（FACS）、荧光原位杂交（FISH）及其他生物分析应用。
NHS酯可在pH 7-9的条件下与伯胺（如赖氨酸侧链或氨基硅烷包被的表面）发生高效选择性反应，形成稳定的共价酰胺键。这一特性使得AATOM™ 488 NHS酯成为标记肽段和氨基修饰寡核苷酸的理想选择。对于抗体和蛋白质标记，我们强烈推荐使用具有高水溶性且经蛋白质标记优化的iFluor®系列染料。
本产品由AAT Bioquest生产，与ATTO-TEC GmbH无关联。
溶液配制
除非另有说明，所有未使用的储备液应在制备后分装，在 -20°C 下储存避免反复冻融
1.准备蛋白质储备溶液（溶液A）：
将 100 µL 反应缓冲液（例如，pH 值约为 8.5 至 9.0 的 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M 磷酸盐缓冲液）与 900 µL 目标蛋白溶液（例如，抗体、蛋白质浓度 > 2 mg/mL（如果可能））混合得到 1 mL 蛋白质标记储备液。
注1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。
注2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，除去蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。
注3：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，获得好的标记结果。
注4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，标记效率会显着降低。为获得合适标记效率，建议蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
2.准备染料储备溶液（溶液B）：
将无水DMSO加入到AATOM488 NHS 酯小瓶中制备10mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。
注意：在开始缀合前准备染料储备溶液（溶液B），立即使用。 染料储备溶液的长期储存会降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周，避光保存。 避免反复冻融。
样本实验方案
（本方案适用AATOM488 NHS 酯标记山羊抗小鼠 IgG，每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。）
进行偶联反应：
1.使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到样品瓶中。蛋白质溶液（95μl溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL，蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。
注意：建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10:1。如果太少或太高，可以尝试5:1、15:1和20:1来确定合适的染料/蛋白质比。
2.在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟
纯化偶联
（以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的一个例子）
1.按照产品说明准备Sephadex G-25柱。
2.将“进行偶联反应”步骤中的反应混合物装入Sephadex G-25柱的顶部。
3.当样品刚低于顶部树脂表面时，立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。
4.向样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）完成柱子纯化。将含有目标染料-蛋白质缀合物的组分合并。
注意：如果需要立即使用，染料-蛋白质缀合物物需要用染色缓冲液稀释，并分装。
注意：为了长期储存，染料蛋白缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。
表征所需的染料-蛋白质偶联物
取代度 (DOS) 是表征染料标记蛋白质的重要因素。较低 DOS 的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高 DOS（例如 DOS > 6）的蛋白质也往往具有减弱的荧光。大多数抗体的 DOS 建议在 2 到 10 之间，具体取决于染料和蛋白质的特性。为了有效标记，取代度应控制为每摩尔抗体有 6-8 摩尔 AATOM 488 NHS 酯。以下步骤用于确定 AATOM 488 NHS 酯标记蛋白的 DOS。
检测吸收率
要测量染料-蛋白质缀合物的吸收光谱，建议根据染料的消光系数将样品浓度保持在 1-10 µM 范围内。
读取 280 nm 处的 OD（吸光度）和染料吸光度（对于 AATOM 488 NHS 酯，ƛmax = 499 nm ）
对于大多数分光光度计，样品（来自柱馏分）需要用去离子水稀释，以便 O.D.值范围为 0.1 至 0.9。外径（吸光度）280 nm 是蛋白质的吸收，而 499 nm 是 AATOM 488 NHS 酯的吸收。为了获得准确的 DOS，请确保缀合物不含非缀合染料。
计算DOS
您可以通过以下链接使用我们的工具计算 DOS：https://www.aatbio.com/tools/degree-of-labeling-calculator
试剂应用文献
