Amplite 比色法生物素定量试剂盒

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产品优势  

1.HABA与亲和素结合时会产生显著光谱变化

2.生物素可竞争性置换HABA-亲和素复合物中的HABA

3.通过监测500 nm处吸光度下降值定量生物素浓度

 

适用范围

用于生物素-蛋白偶联物中生物素与蛋白质的摩尔比，也用于溶液中生物素浓度的定量分析

 

产品介绍

亲和素/链霉亲和素与生物素的相互作用是已知最强的蛋白质-配体非共价生物结合（解离常数Kd=10⁻¹⁵ M⁻¹），每个亲和素分子可特异性结合四个生物素分子。这种结合具有三个显著特征：1）结合过程极其迅速；2）一旦形成复合物，其结构稳定性极高，不受pH值、有机溶剂及其他变性剂的影响；3）这种结合具有本质不可逆性，只有通过破坏蛋白质亚基结构才能释放已结合的生物素分子。

这种独特而强大的相互作用，生物素及其衍生物与各种亲和素的紧密结合特性已被广泛应用于多种生物学领域。Amplite®比色法生物素定量检测试剂盒正是利用这一原理，开发出了便捷的生物素定量解决方案。该试剂盒可精确测定生物素-蛋白偶联物中生物素与蛋白质的摩尔比，也可用于溶液中生物素浓度的定量分析。

Amplite®比色法生物素定量检测试剂盒采用HABA（4'-羟基偶氮苯-2-羧酸）作为检测试剂，其与亲和素结合时会产生显著的光谱变化。当生物素存在时，会竞争性取代HABA-亲和素复合物中的HABA，导致500nm波长处的吸光度下降，通过检测这一变化即可实现生物素的精确定量。本试剂盒的最合适的检测范围为2-16μM，支持比色皿和微孔板两种检测模式，为研究人员提供了灵活的实验选择。

样品实验方案

操作流程概要

1.配制180 µL HABA/亲和素检测混合液

2.加入20 µL测试样本

3.室温孵育5分钟

4.监测500 nm波长处吸光度下降值

 

储备溶液配制

所有未使用的储备液应分装后于-20°C保存，避免反复冻融

亲和素储备液（100X）：

向亲和素（组分A）瓶中加入400 µL双蒸水（ddH₂O），混匀

注：未使用的100X亲和素储备液需分装保存于-20°C

工作液配制

HABA/亲和素检测溶液：

取20 mL HABA检测缓冲液（组分B），加入200 µL 100X亲和素储备液，充分混匀

注：未使用的混合液可4°C保存一周

 

操作步骤

使用96孔微孔板定量生物素 

表1.含有生物素的测试样品的布局，白色/透明底96孔微孔板中的阴性或阳性对照。 NC =阴性对照，PC =阳性对照，TS =测试样品

NC	NC	TS	TS
PC	PC	...	...
TS	TS	...	...

 

表2.每个孔的试剂组成

阳性	阴性	样品
组分C：20ul	ddH2O: 20ul	20ul

 

注意事项

1.需对含生物素样本进行梯度稀释测试，确保最终检测浓度处于2-16 μM线性范围内

2.避免使用含钾离子缓冲液，否则会导致反应体系沉淀

3.游离生物素必须通过凝胶过滤或透析与生物素化蛋白分离

 

加样步骤（96孔板）

1.按表1和表2所示，向透明底96孔板中分别加入：20 μL含生物素样本、20 μL阴性对照（ddH₂O或样本溶解缓冲液）、20 μL阳性对照（组分C）

2.每孔加入180 μL HABA/亲和素检测工作液，总体积：200 μL/孔，比色皿模式：100 μL样本 + 900 μL工作液

3.室温避光孵育5分钟

4.平板振荡器100-200 rpm温和震荡；操作提示：移液时避免产生气泡

5.使用酶标仪在500 nm波长下监测吸光度下降值

 

试剂应用文献

Generation of shark Single-Domain antibodies as an aid for Cryo-EM structure determination of membrane Proteins: Use hyaluronan synthase as an example
Authors: Deng, Penghui and Zhang, Xiaoyue and Wen, Jianqing and Xu, Mingce and Li, Pengwei and Wang, Hao and Bi, Yunchen
Journal: Journal of Structural Biology: X (2025): 100126