Amplite 比色法过氧化氢检测试剂盒

产品货期

咨询

 

产品优势  

"混合即读"型操作，适用于高通量筛选（HTS）液体处理仪器。

 

适用范围

用于过氧化氢检测

 

产品介绍

过氧化氢（H₂O₂）是一种活性氧代谢副产物，作为多种氧化应激相关状态的关键调节因子。它参与诸多生物学过程，与哮喘、动脉粥样硬化、糖尿病血管病变、骨质疏松症、多种神经退行性疾病及唐氏综合症密切相关。过氧化氢生物学中最引人注目的发现，是近期研究揭示抗体能够将分子氧转化为过氧化氢，从而参与免疫系统的正常识别与清除机制。对该活性分子的检测将有助于阐明氧化应激如何调控多种细胞内通路。

Amplite®比色法过氧化氢检测试剂盒采用独特的Amplite® IR过氧化物酶底物，可精准定量溶液及细胞裂解液中的过氧化氢。当发生过氧化氢氧化反应时，无色的Amplite® IR会生成强烈的蓝色产物，且在pH 4-10范围内不受酸碱度影响。现有（其他厂商的）比色法过氧化氢检测常因生物样本自身吸光度而产生严重干扰，而Amplite® IR产物的近红外吸收特性可显著降低检测背景——因生物样本在600 nm以上波长几乎无吸光。该试剂盒还可通过酶偶联反应检测多种氧化酶活性，提供优化的"混合即读"检测方案，兼容高通量液体处理仪器。

 

适用仪器

---

光吸收酶标仪
吸收:	650nm
推荐孔板:	透明底板

样品实验方案

简要概述

1.准备H₂O₂工作溶液（50μL）
2.添加H₂O₂标准品或测试样品（50μL）
3.在室温下孵育10-60分钟
4.监测650 nm处的吸光度

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融。
1. Amplite IR过氧化物酶底物储备液（100X）：
将250μLDMSO（组分E）加入到Amplite IR过氧化物酶底物（组分A）的小瓶中。

2.过氧化物酶原液（20 U / mL）：
将1mL测定缓冲液（组分C）加入到辣根过氧化物酶（组分D）的小瓶中。

3. H₂O₂标准溶液（20 mM）：
将22.7μL的3％H₂O₂（0.88M，组分B）加入977μL的测定缓冲液（组分C）中。 注意：稀释的H₂O₂储备溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。

 

2.标准溶液

H₂O₂标准
将5μL20mM H₂O₂标准溶液加入995μL测定缓冲液（组分C）中，得到100μM H₂O₂标准品（HS7）。 取200μL100μM H₂O₂标准品进行1：2连续稀释，得到 H₂O₂标准品（HS6-HS1）的连续稀释液。

 

3.工作溶液

将50μLEKYellow 储备液和50μL肠激酶底物储备液加入5 mL分析缓冲液（组分C）中; 混合均匀，制成肠激酶（EK）工作溶液（组分A + B + C）。 注意：对于一个96孔板，测定混合物就足够了。 它不稳定，立即使用。

 

样品分析

表1.白壁/透明底96孔板中H2O2标准品和测试样品的布局。 HS = H2O2标准品（HS1-HS7,1.563至100μM）; BL =空白对照; TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
HS1	HS1	...	...
HS2	HS2	...	...
HS3	HS3
HS4	HS4
HS5	HS5
HS6	HS6
HS7	HS7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
HS1-HS7	50ul	连续稀释（1.563至100μM）
BL	50ul	分析缓冲液（组分B）
TS	50ul	测试样本

1.H₂O₂测定上清液反应

1.1根据表1和2中提供的布局制备H2O2标准品（HS），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。

1.2向H₂O₂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLH₂O₂工作溶液，使总H₂O₂测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLH₂O₂工作溶液，总体积为50μL/孔。

1.3在室温下孵育反应10至30分钟，避光。

1.4用吸光度读板仪在650nm处监测吸光度。

 

H₂O₂测定细胞
Amplite 比色过氧化氢检测试剂盒可用于测量细胞中H₂O₂的释放。以下是建议的说明书，可以进行修改以满足特定的研究需求。

除了应使用细胞培养系统中使用的培养基替换测定缓冲液（组分C）外，应按照给定的方式制备H₂O₂细胞工作溶液。建议的培养基包括（a）Krebs Ringers磷酸盐缓冲液（KRPB）; （b）中。汉克斯平衡盐溶液（HBSS）;或（c）无血清培养基。

在96孔板（50-100μL/孔）中制备细胞，并根据需要细胞。

注意：包括阴性对照（单独的培养基和非活化细胞）用于测量背景荧光。

向细胞和H₂O₂标准品的每个孔中加入50μL H₂O₂细胞工作溶液，使总H2O2测定体积为100μL/孔。对于384孔板，在每个孔中加入25μLH₂O₂细胞工作溶液，总体积为50μL/孔。

在室温下孵育反应10至60分钟，避光。

用吸光度读板仪在650nm处监测吸光度。