Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒(比色法)
Ex (nm) | - | Em (nm) | - |
分子量 | - | 溶剂 | - |
存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
产品货期
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产品优势
1.灵敏度高,在100 μL反应体系中可检测低至3 μM的NADPH
2.兼容96孔或384孔微孔板形式
适用范围
用于NAD/NADH比率检测
产品介绍
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)是细胞内两种重要的辅因子。NADH是NAD+的还原形式,NAD+则是NADH的氧化形式。通过在腺苷核苷酸2'位引入磷酸酯键,可形成NADP。NADP主要参与需要还原剂NADPH的合成代谢反应(如脂肪酸与核酸合成)。传统的NAD/NADH和NADP/NADPH检测通过监测340 nm处NADH或NADPH的吸光度实现。由于该紫外波段检测需使用昂贵的石英微孔板,存在灵敏度低、干扰性强的问题。我们的Amplite® NADP/NADPH比率检测试剂盒提供了一种灵敏便捷的NADP、NADPH及其比率检测方案。
Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒(比色法)中的NADPH探针是一种显色传感器,经NADPH还原后在~460 nm处产生最大吸光度。吸光度增幅与溶液中NADPH浓度成正比。该探针无需酶催化即可特异性识别NADPH,信号可通过普通酶标仪在~460 nm处读取。Amplite®比色法NADPH检测试剂盒灵敏度好,在100 μL反应体系中可检测低至3 μM的NADPH,支持96孔或384孔微孔板的高通量检测。
吸光度酶标仪 | |
吸光度: | 460 nm |
推荐孔板: | 透明底板 |
96孔板检测示例
概述
准备25μLNADPH标准品和/或测试样品
加入25μLNADPH提取液
在室温下孵育15分钟
加入25μL中和溶液
加入75μLNADPP/ NADPH反应混合物在室温下孵育15分钟至2小时监测 在460nm处的吸光度
注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作步骤
1.准备NADPH原液:
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。
注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.制备NADP / NADPH反应混合物:
2.1将8mL NADPH探针缓冲液(组分B-II)加入到NADP / NADPH回收酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。
2.2将2 mL NADPH探针(组分B-I)加入上述瓶中(来自步骤2.1)并充分混合。
注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以进行125~200次分析。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。
3.准备连续稀释的NADPH标准品(0至2μM):
3.1将2L 1mM NADPH储备溶液(来自步骤1)加入998L PBS缓冲液(pH7.4)中,产生2M(2 pmols / L)NADPH标准溶液。
注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。
3.2取200μL2MNADPH标准溶液(来自步骤3.1)进行1:2连续稀释,得到1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀释的NADPH标准品。
4.运行总NADP / NADPH分析(总共400个分析/试剂盒):
4.1如说明书中的表1和2中所述,将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见,裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞。 (详见附录)。
4.2将50μL的NADP / NADPH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品(来自步骤4.1)的每个孔中,以使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔。
4.3在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。
4.4使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。
5.运行NADP / NADPH比率分析(总共250个分析/试剂盒):
5.1如说明书中的表3和4中所述,将连续稀释的NADPH标准品和/或含NADP / NADPH的测试样品加入白色/透明96孔微量培养板中。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见,裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞。
5.2对于NADPH提取(NADPH量):将25μLNADPH提取溶液(组分D)加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟,然后加入25μL中和溶液(组分E)以中和NADPH提取物,如说明书中的表3和4中所述。
对于总NADP和NADPH(总量):将25μLNADPP/ NADPH对照溶液(组分F)加入NADPH标准品的孔和含有NADP / NADPH的测试样品中。在室温下孵育10至15分钟,然后如说明书中的表3和4中所述添加25μL提取对照溶液(组分F)。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见,裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞(详见附录)。
5.3将75μL的NADP / NADPH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品(NADP / NADPH)的每个孔中,并测试样品(NADPH提取物)(来自步骤5.1)以使总量达到测定体积为150μL/孔。
5.4在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。
5.5使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。
数据分析
空白孔中的吸光度(仅PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。
图1. Amplite™比色NADP / NADPH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪(Molecular devices)测量白色/透明96孔微量培养板中的总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。
A-总NADPH和NADP剂量反应:孵育1小时可检测到低至0.03μM的总NADPH。
B-NADP / NADPH比例:用或不用NADP提取溶液处理等量的NADP和NADPH混合物15分钟,然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 NADP / NADPH摩尔比基于图1B中所示的吸光度计算。
附录:使用组分G(NAD / NADH裂解缓冲液)的测试样品制剂
1.植物细胞样品:
用裂解缓冲液以200mg / mL均化,并以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测试。
2.样品:
离心收集细胞((10,000 g,0°C,15 min)。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液,将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟, 用上清液进行试验。
3.哺乳动物细胞样本:
从平板孔中取出培养基,每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液(或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔),并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟,使用上清液进行测试。
4.组织样品:
称取约20mg组织,用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测定。