Amplite 总NAD和NADH检测试剂盒(比色法)

产品货期

咨询

 

产品优势

通过酶循环反应精准识别NAD/NADH，无需从样品混合物中纯化。

 

适用范围

用于总NAD和NADH检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）及其磷酸化衍生物（NADP⁺）是细胞代谢过程中不可或缺的辅酶。其中，NADH作为NAD⁺的还原形态，而NAD⁺则是NADH的氧化形态。当腺苷核苷酸2'位通过酯键连接磷酸基团后，NAD⁺即转化为NADP⁺。NADP⁺作为重要辅酶，在需要还原剂NADPH参与的合成代谢反应（如脂肪酸与核酸合成）中发挥关键作用。在叶绿体中，NADP⁺作为氧化剂参与光合作用初始反应，所产生的NADPH随后为光合作用卡尔文循环中的生物合成反应提供还原当量。传统检测方法通过监测340nm处NADH或NADPH的特征吸收来实现定量分析。然而，由于该方法需在紫外区使用昂贵的石英微孔板，且存在灵敏度不足、干扰性强等固有局限。

Amplite 总NAD和NADH检测试剂盒（比色法）创新性地采用酶循环反应技术，通过特异性识别NAD/NADH实现高灵敏度检测。该技术无需预先纯化样本，通过高效的酶循环放大机制显著提升检测灵敏度（检测限可达nM级），克服了传统紫外法的技术瓶颈。

 

适用仪器

---

光吸收酶标仪
吸收:	570/610nm
推荐孔板:	透明底板

96孔板测定示例

概述

准备NAD / NADH反应混合物（50μL）

添加NADH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟--2小时

检测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

 

操作方法

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物：

将10mL NAD / NADH缓冲液（组分B）加入NAD / NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至10μM）：

3.1将10μL的NADH储备溶液（来自步骤1）加入到990L PBS缓冲液（pH 7.4）中，以产生10μM（10pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL 10μM NADH标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入到黑色96孔板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1黑色96孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

 

表2.每个孔的试剂组成

NADH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

注意：将连续稀释的NADH标准品（0.01μM至10μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，终浓度）可能由于NADH探针（对非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

 

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定：

4.1将50μL的NADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.3）的每个孔中，使得总NADH测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光酶标仪检测荧光。

注1：也可将板的混合物转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2：对于NAD / NADH比率测量，建议使用试剂盒15263。

注意3：对于细胞的NAD / NADH检测，建议使用ReadiUse 哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（货号：20012）裂解细胞。