Amplite 总NAD和NADH检测试剂盒（比色法）增强灵敏度

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产品优势  

1.灵敏度高

2.特异性识别 NAD/NADH，无需从样品混合物中纯化 NAD/NADH

 

适用范围

用于总NAD和NADH检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）是细胞内两种重要的辅因子。NADH是NAD+的还原形式，而NAD+则是NADH的氧化形式。通过在腺苷核苷酸2'位形成磷酸酯键，可生成NADP。NADP主要作为还原力供体参与合成代谢反应（如脂肪酸和核酸合成），其还原形式NADPH在这些过程中发挥关键作用。在叶绿体中，NADP作为氧化剂参与光合作用的前期反应，所产生的NADPH随后为光合作用卡尔文循环中的生物合成反应提供还原力。传统的NAD/NADH和NADP/NADPH检测依赖于340 nm处NADH或NADPH的吸光度监测。由于该紫外波段检测需使用昂贵的石英微孔板，且存在灵敏度低、干扰性强等局限。

Amplite 总NAD和NADH检测试剂盒 （比色法）是一种便捷且灵敏的 NAD 和 NADH 检测方法。系统中的酶可在酶循环反应中特异性识别 NAD/NADH。无需从样品混合物中纯化 NAD/NADH。酶循环反应显著提高了检测灵敏度。与试剂盒 #15258 相比，该试剂盒具有更高的灵敏度。

 

96孔板检测示例

概述

准备NAD / NADH反应混合物（50μL）

加入NADH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟至2小时

监测460 nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。

 

2.准备NAD / NADH反应混合物：

2.1将8 mL NADH探针缓冲液（组分B-II）加入到NAD / NADH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

2.2将2 mL NADH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。

注意：这种NAD / NADH反应混合物足以进行200次分析。未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至10μM）：

3.1将10μL1mMNADH储备溶液（来自步骤1）加入990L PBS缓冲液（pH7.4）中，得到10μM（10pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10M NADH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 M系列稀释的NADH标准品。

3.3如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1：白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

 

表2：每个孔的试剂组成

NADH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

*注意：将连续稀释的NADH标准品（0.078μM至5μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

 

4.在上清液反应中运行NADH测定：

4.1将50μLNAD/ NADH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NAD / NADH测定体积为100μL/孔

注意1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

注意2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂

 

1.植物细胞样品：

用裂解缓冲液以200mg / mL均化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

 

2.细菌样品：

离心收集细菌细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟， 用上清液进行试验。

 

3.哺乳动物细胞样本：

从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

 

4.组织样品：

称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。