Amplite 总NADP和NADPH检测试剂盒（比色法）增强灵敏度

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产品优势  

1.酶循环反应显著提升检测灵敏度

2.特异性识别 NAD/NADH，无需从样品混合物中纯化 NAD/NADH

 

适用范围

用于总NAD和NADH检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）及其磷酸化形式烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）是细胞中至关重要的辅酶分子。其中，NADH作为NAD+的还原态存在，二者通过氧化还原反应相互转化。当腺苷核苷酸2'位羟基发生磷酸酯化修饰时，NAD+即转化为NADP。在代谢过程中，NADP的还原态NADPH作为关键还原当量，驱动脂肪酸、核酸等生物合成反应。特别值得注意的是，在叶绿体光合作用体系中，NADP作为初始光反应的氧化剂，其还原产物NADPH继而成为卡尔文循环碳同化反应的还原力来源。传统基于340nm紫外吸光度的NAD(P)/NAD(P)H检测方法存在明显局限：不仅需要配备昂贵的石英微孔板，更因紫外区干扰因素多而导致灵敏度欠佳。

Amplite 总NADP和NADPH检测试剂盒 （比色法）用酶循环放大技术，无需从样品混合物中纯化 NAD/NADH即可实现高灵敏度检测：1）特异性酶系统精准识别NADP/NADPH；2）酶循环反应显著提升检测灵敏度；3）较之#15260试剂盒，本产品灵敏度好。

 

96孔板检测示例

概述

准备NADP / NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟至2小时

监测460nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.制备NADP / NADPH反应混合物：

2.1将8mL NADPH探针缓冲液（组分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

2.2将2 mL NADPH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。

注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以进行200次分析。未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至2μM）：

3.1将2L 1mM NADPH储备溶液（来自步骤1）加入998L PBS缓冲液（pH7.4）中，产生2M（2 pmols / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL2MNADPH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀释的NADPH标准品。

3.3如表1和2中所述，将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。 （详见附录）。 

 

表1：白色/透明底96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

 

表2：每个孔的试剂组成

NADPH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

*注意：将连续稀释的NADPH标准品（0.0313μM至2μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADPH（例如，>30μM，终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

 

4.在上清液反应中运行NADPH测定：

4.1将50μL的NADP / NADPH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔

注意1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADP/ NADPH反应混合物。

注意2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。 （详见附录）。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂

 

1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

2.细胞样品：离心收集细胞（（10,000 g，℃，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟，并用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。