Amplite 荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒 绿色荧光

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产品优势

可灵敏区分LacZ阳性与阴性细胞

 

适用范围

用于β-半乳糖苷酶检测

 

产品介绍

大肠杆菌β-半乳糖苷酶是一种分子量为464kDa的四聚体蛋白，其每个亚基包含五个结构域，其中第三个结构域为酶活性中心。该酶是细胞内的重要功能蛋白，其活性缺陷可能导致半乳糖唾液酸贮积症或Morquio B综合征。在大肠杆菌中，β-半乳糖苷酶的表达受LacZ操纵子调控，现有检测技术已能实现单细胞中低至5个酶分子的检测灵敏度。

本试剂盒采用荧光底物技术，可灵敏区分LacZ阳性与阴性细胞。既适用于ELISA类检测系统中的酶偶联物分析，也可用于细胞LacZ基因表达监测。经β-半乳糖苷酶切割后的荧光产物，其发射光谱与FITC滤光片组兼容，可在多数荧光检测设备上完成测定。

样品实验方案

简要概述

1.用LacZ基因制备稳定或瞬时转染的细胞
2.用测试化合物孵育细胞（样品）
3.裂解细胞
4.将裂解液转移至微量滴定板
5.添加FDG工作解决方案
6.根据细胞类型，在室温或37°C孵育至少5分钟
7.添加停止解决方案
8.监测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 FDG储备溶液（1倍）：
将125 µL DMSO（组分E）加入FDG（组分A）小瓶中，制成1X FDG储备液。 注意：25 µL FDG足以装满1个板，避光。

 

2.标准溶液

β-半乳糖苷酶标准品
可选（如果需要标准曲线）：用0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液制备一系列β-半乳糖苷酶（大肠杆菌）标准品的稀释液。 将标准曲线上每个点的等分试样50 µL转移至平板的对照孔中。 β-半乳糖苷酶的高推荐量为200 mU / mL（200-400 ng）。 建议对标准曲线进行2倍系列稀释，包括8个点。 注意：调整标准曲线以适合特定的实验条件，例如细胞类型，数量，转染效率和培养板的大小。 每次进行测定时，必须新鲜制备标准曲线的稀释液。

 

3.工作溶液

3.1 0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液：
将30 µLβ-巯基乙醇（组分F）添加到10 mL反应缓冲液（组分B）中，并充分混合。
注意：制备酶稀释缓冲液需要额外的缓冲液，用于生成标准曲线。

3.2 FDG工作方案：
将25 µL 1X FDG储备溶液加到5 mL的0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液中。 注意：请勿将FDG溶液在室温下长时间放置，否则会发生自发水解。

3.3 裂解缓冲液工作液：
使用前，将5 µLβ-巯基乙醇（组分F）加入5 mL裂解缓冲液（组分D）中。 注意：在裂解细胞之前，将0.1％β-巯基乙醇添加到裂解缓冲液中

 

样品操作及分析

表1.细胞培养板推荐的Lysis Buffer工作溶液体积

培养板类型	裂解缓冲液工作溶液（µL /孔）
96孔板	50
24孔板	250
12孔板	500
6孔板	1000
60毫米板	2000
100毫米板	4000

1.从哺乳动物细胞制备细胞提取物

1.1用测试化合物处理含有LacZ基因的细胞所需的时间。

1.2用1X PBS洗涤细胞两次。不要移动细胞。

1.3用Lysis Buffer工作溶液相应地裂解细胞。

1.3.1对于贴壁细胞：将Lysis Buffer工作溶液添加至培养板。有关建议的数量，请参见表1。

1.3.2对于非贴壁细胞：将细胞沉淀到离心管中，并向管中加入50-2000 µL Lysis Buffer工作溶液（取决于细胞沉淀的大小）。

1.4将上一步的细胞在室温下孵育10-15分钟，然后轻轻旋转平板或试管数次以确保完全裂解。

1.5继续进行FDG测定或将样品在-80°C下冷冻直至使用。注意：通过快速的冻融循环（在-20°C到-80°C冷冻1-2小时，然后在室温解冻）也可以获得良好的裂解。或者，将细胞裂解液离心2-3分钟以沉淀不溶物，然后测定上清液。

 

2.运行ß-半乳糖苷酶测定

2.1如果需要，在室温下解冻裂解细胞管或板。如果细胞接种在96孔板上，则直接在96孔板上进行测定。

2.2在96孔板的每个孔中加入50 µL细胞提取物。如果需要标准曲线，请为标准曲线保存一些对照孔（50 uL /孔）。注意：如有必要，当转染效率很高时，可在裂解缓冲液工作溶液中稀释裂解液，或在转染效率低时减少裂解液的体积。如果在96孔板上进行转染，或将稳定的细胞系接种到96孔板上，请直接在板上进行测定。对于内源性β-半乳糖苷酶活性控制，请添加50 µL非转染细胞的细胞裂解液。对于空白对照，添加50 µL 1X裂解缓冲液。

2.3向每个孔中加入50 µL FDG工作溶液。根据细胞类型，将板在室温或37°C下孵育大约5分钟至4小时。

2.4向每个孔中添加50 µL终止缓冲液（组分C）。终止缓冲液除了终止反应之外，还引起产物的荧光强度增加。

2.5用荧光酶标仪在Ex / Em = 490/525 nm处测量每个孔中溶液的荧光强度。

2.6根据线性标准曲线定量ß-半乳糖苷酶表达。