Amplite 荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒 红色荧光

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产品优势

兼容荧光酶标仪、荧光显微镜和流式细胞仪等多种检测平台

 

适用范围

用于β-半乳糖苷酶检测

 

产品介绍

大肠杆菌β-半乳糖苷酶是一种464kD的四聚体蛋白，其每个亚基包含五个结构域，其中第三个结构域为活性位点。该酶是细胞内的关键酶类，其缺陷可能导致半乳糖唾液酸贮积症或Morquio B综合征。在大肠杆菌中，β-半乳糖苷酶通过LacZ操纵子的激活而产生。目前，检测技术已可灵敏到每个细胞中仅5个β-半乳糖苷酶分子也能被检出。

Amplite®荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒采用红色荧光底物，可灵敏区分LacZ阳性与阴性细胞。其原理是：非荧光底物经β-半乳糖苷酶作用后产生强荧光产物。该试剂盒既可用于ELISA类检测系统中的酶偶联物检测，也可用于细胞中LacZ基因表达的监测。试剂盒提供所有必需组分及优化方案，兼容荧光酶标仪、荧光显微镜和流式细胞仪等多种检测平台，还可用于β-半乳糖苷酶抑制剂或诱导剂的筛选。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.用LacZ基因制备稳定或瞬时转染的细胞
2.用测试化合物孵育细胞（样品）
3.裂解细胞
4.将裂解液转移至微量滴定板
5.添加β-Gal工作液
6.根据细胞类型，在室温或37°C孵育至少10分钟
7.添加停止反应试剂
8.监测Ex / Em = 540/590 nm的荧光强度

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 β-半乳糖苷酶底物储备液（200X）：
将50 µL DMSO（组分E）添加到试卤灵β-半乳糖苷酶（组分A）的小瓶中，制成200Xβ-半乳糖苷酶底物原液。

注意：25 µLβ-半乳糖苷酶底物储备液足以容纳1个板，避光。

 

2.标准溶液

β-半乳糖苷酶标准品
可选（如果需要标准曲线）：用0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液制备一系列β-半乳糖苷酶（大肠杆菌）标准品的稀释液。 将标准曲线上每个点的等分试样50 µL转移至平板的对照孔中。 β-半乳糖苷酶的高推荐量为200 mU / mL（200-400 ng）。建议按1：3的比例稀释由8个点组成的标准曲线。

注意：调整标准曲线以适合特定的实验条件，例如细胞类型，数量，转染效率和培养板的大小。 每次进行测定时，必须新鲜制备标准曲线的稀释液。

 

3.工作溶液

1.1 0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液：
将30 µLβ-巯基乙醇（组分F）添加到10 mL反应缓冲液（组分B）中，并充分混合。 注意：制备酶稀释缓冲液需要额外的缓冲液，用于生成标准曲线。

1.2 β-Gal工作液：
将25 µLβ-半乳糖苷酶底物储备液（200X）加入5 mL的0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液中。 注意：β-Gal工作溶液足以用于一块96孔板。

1.3 裂解缓冲液工作液：
使用前，将5 µLβ-巯基乙醇（组分F）加入5 mL裂解缓冲液（组分D）中。 注意：在裂解细胞之前，将0.1％β-巯基乙醇添加到裂解缓冲液中。

 

样品操作及分析

表1.细胞培养板推荐的Lysis Buffer工作溶液体积

培养板类型	裂解缓冲液工作溶液（µL /孔）
96孔板	50
24孔板	250
12孔板	500
6孔板	1000
60毫米板	2000
100毫米板	4000

1.从哺乳动物细胞制备细胞提取物

1.1用测试化合物处理含有LacZ基因的细胞所需的时间。

1.2用1X PBS洗涤细胞两次。不要移动细胞。

1.3用Lysis Buffer工作溶液相应地裂解细胞。

1.3.1对于贴壁细胞：将Lysis Buffer工作溶液添加至培养板。有关建议的数量，请参见表1。

1.3.2对于非贴壁细胞：将细胞沉淀到离心管中，并向管中加入50-2000 µL Lysis Buffer工作溶液（取决于细胞沉淀的大小）。

1.4将上一步的细胞在室温下孵育10-15分钟，然后轻轻旋转平板或试管数次以确保完全裂解。

1.5继续进行β-半乳糖苷酶测定，或将样品在-80°C下冷冻直至使用。注意：通过快速的冻融循环（在-20°C到-80°C冷冻1-2小时，然后在室温解冻）也可以获得良好的裂解。或者，将细胞裂解液离心2-3分钟以沉淀不溶物，然后测定上清液。

 

2.运行ß-半乳糖苷酶测定

2.1如果需要，在室温下解冻裂解细胞管或板。如果细胞接种在96孔板上，则直接在96孔板上进行测定。

2.2在96孔板的每个孔中加入50 µL细胞提取物。如果需要标准曲线，请为标准曲线保存一些对照孔（50 uL /孔）。

注意：如有必要，当转染效率很高时，可在裂解缓冲液工作溶液中稀释裂解液，或在转染效率低时减少裂解液的体积。如果在96孔板上进行转染，或将稳定的细胞系接种到96孔板上，请直接在板上进行测定。对于内源性β-半乳糖苷酶活性控制，请添加50 µL非转染细胞的细胞裂解液。对于空白对照，添加50 µL Lysis Buffer工作溶液。

2.3向每个孔中加入50 µLß-Gal工作溶液。根据细胞类型，将板在室温或37°C下孵育大约10分钟至4小时。

2.4向每个孔中添加50 µL终止缓冲液（组分C）。终止缓冲液除了终止反应之外，还引起产物的荧光强度增加。

2.5用荧光酶标仪在Ex / Em = 540/590 nm（截止值= 570 nm）下测量每个孔中溶液的荧光强度。