Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒 蓝色荧光

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适用范围

用于caspase-3活性检测

 

产品介绍

半胱天冬酶（Caspases）在细胞凋亡和信号转导过程中发挥关键作用。其中，caspase-3（CPP32/apopain）的激活是启动细胞凋亡的重要环节，该酶现已被确认为药物筛选靶点。caspase-3对含有Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）序列的肽段具有特异性识别能力。

Amplite® Caspase-3检测试剂盒采用Ac-DEVD-AMC作为荧光底物，其检测原理是：当AMC标记的底物被caspase切割后，会释放出强荧光物质AMC（激发波长340-350 nm，发射波长440-460 nm）。该试剂盒可通过荧光酶标仪或荧光分光光度计，实时检测细胞裂解液或纯化酶制剂中的caspase-3活性。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	350nm
Em:	450nm
Cutoff:	420nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

 

概述

用测试化合物制备细胞（100μL/孔用于96孔板或25μL/孔用于384孔板）

加入等体积的Caspase 3/7测定溶液

在室温下孵育1小时

监测Ex的荧光强度 / Em = 350 / 450nm

 

操作方法

1.准备细胞：

1.1对于贴壁细胞：在生长培养基中将细胞在20,000至80,000个细胞/孔/ 90L过夜，96孔板或5,000至20,000个细胞/孔/ 20L，用于384孔板。

1.2对于非粘附细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀悬浮于培养基中，培养基浓度为80,000至200,000细胞/孔/ 90L，用于96孔poly-D赖氨酸平板或20,000至50,000细胞/孔/ 20L用于384孔聚-D赖氨酸板。在实验之前，在制动器关闭的情况下以800rpm离心板2分钟。

注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的佳细胞密度。

2.准备库存解决方案：

2.1在使用前，在室温下使用组分A，B，C（如果需要，组分D）。

2.2如果需要，制备1mM Caspase 3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO储备液：将100μLDMSO（未提供）直接加入到Caspase 3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO小瓶中（组分D） ）。该抑制剂可用于确认荧光信号强度与Caspase 3/7样蛋白酶活性之间的相关性。

注意：应将未使用的抑制剂储备液等分并在-20°C下干燥储存。

3.准备Caspase 3/7检测溶液：

将50μL200XCaspase 3/7底物储备溶液（组分A）和100μL1MDTT溶液（组分C）加入10mL测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。

注意：50μL的200X Caspase 3/7底物储备液足以进行100次分析，每次分析的反应体积为100μL。未使用的200X Caspase 3/7底物储备溶液应等分并在-20°C下干燥储存。远离光明。

4.运行Caspase 3/7测定：

4.1通过在PBS或所需缓冲液中加入10μL10X测试化合物（96孔板）或5μL5X测试化合物（384-板）来处理细胞。对于空白孔（没有细胞的培养基），加入相应量的化合物缓冲液。

4.2将细胞板在37℃，5％CO 2培养箱中培养所需的一段时间（用喜树碱处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。

4.3加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Caspase 3/7测定溶液（来自步骤3）。

4.4在室温下孵育板至少1小时，避光。

注1：如果需要，在室温下加入测定溶液10分钟前，将1L Caspase 3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO的1mM储备液（来自步骤2.2）加入所选样品，以确认caspase 3 / 7个类似的活动。

4.5在制动器关闭的情况下，以800rpm离心细胞板（特别是对于非贴壁细胞）2分钟。

4.6在Ex / Em = 350 / 450nm处观察荧光增加。