Amplite 荧光法过氧化氢酶检测试剂盒 红色荧光

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产品优势  

超灵敏检测：在100 µL反应体系中可检测低至30 mU/mL的过氧化氢酶活性

 

适用范围

用于检测过氧化氢酶活性。

 

产品介绍

过氧化氢酶（Catalase）是一种广泛存在于需氧生物体内的抗氧化酶，含有血红素结构并具有氧化还原活性。该酶主要富集于细胞的过氧化物酶体中，在维持细胞氧化还原平衡中发挥关键作用。

过氧化氢（H₂O₂）是需氧代谢过程中产生的活性氧（ROS）之一，也是氧化酶和超氧化物歧化酶反应的毒性副产物。过氧化氢酶通过分解过量的H₂O₂，确保那些会产生H₂O₂副产物的重要细胞进程能够安全进行。

Amplite®荧光法过氧化氢酶检测试剂盒提供了一种快速、灵敏的酶活性检测方案。该试剂盒支持96孔或384孔微孔板检测模式，无需分离步骤即可实现自动化操作。其检测原理基于：过氧化氢酶催化H₂O₂分解为水和氧气，而试剂盒中的Amplite® Red底物会与剩余的H₂O₂反应生成红色荧光产物，因此荧光强度的降低程度与过氧化氢酶活性成正比。

该试剂盒采用Amplite® Red底物，支持双模式检测：既可通过荧光酶标仪（推荐Ex/Em=540/590 nm）也可通过吸光度酶标仪进行读数。在100 μL反应体系中，最低可检测至30 mU/mL的过氧化氢酶活性，具有极高的检测灵敏度。

标准操作流程

实验概览

1.准备过氧化氢酶标准品/测试样本（50μL/孔）

2.加入H₂O₂检测缓冲液（50μL/孔）

3.室温孵育10-30分钟

4.加入过氧化氢酶检测混合液（50μL/孔）

5.室温孵育10-30分钟

6.荧光检测（激发/发射波长=540/590nm，截止波长570nm）

重要注意事项

1.实验前所有组分需室温解冻

2.组分A在硫醇类物质（如DTT、β-巯基乙醇）存在下不稳定

3.硫醇终浓度＞10μM会显著降低检测动态范围

4.NADH及还原型谷胱甘肽（GSH）可能干扰检测

 

储备液配制

（所有储备液需分装保存于-20℃，避免反复冻融）

Amplite™ Red底物储备液（200×）

向组分A中加入65μL DMSO（组分F）现配现用

 

辣根过氧化物酶储备液（100U/mL）

向组分D中加入200μL检测缓冲液（组分C）

 

过氧化氢储备液（10mM）

取10μL 3% H₂O₂（0.88M，组分B）加入870μL检测缓冲液

注：稀释后不稳定，需丢弃剩余溶液

 

H₂O₂检测缓冲液（1×）

取5μL 10mM H₂O₂储备液加入5mL检测缓冲液

 

过氧化氢酶标准液（2U/mL）

取2μL 1000U/mL标准品（组分E）加入1000μL检测缓冲液

 

标准曲线制备

推荐使用稀释计算工具：https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/11306

取2U/mL标准液（CS7）用检测缓冲液按1:2梯度稀释，获得CS6-CS1系列标准液

 

工作液配制

取5mL检测缓冲液（组分C）依次加入：25μL 200× Amplite™ Red底物储备液、15μL 100U/mL HRP储备液充分混匀，避光保存

 

样品实验方案

表1. 过氧化氢酶标准品和测试样品在黑色96孔微孔板中的布局。CS=过氧化氢酶标准品（CS1 - CS7，0.031至2 U/mL），BL=空白对照，TS=测试样品。

BL	BL	TS	TS
CS1	CS1	...	...
CS2	CS2	...	...
CS3	CS3
CS4	CS4
CS5	CS5
CS6	CS6
CS7	CS7

表 2. 每个孔的试剂组成。

Well	Volume	Reagents
CS1 - CS7	50 µL	Serial Dilution (0.031 to 2 U/mL)
BL	50 µL	Assay Buffer (Component C)
TS	50 µL	test sample

 

1.按表1和表2布局配制：过氧化氢酶标准品（CS）、空白对照（BL）、测试样本（TS）。384孔板每孔使用25 µL试剂（替代50 µL）

2.向各孔加入50 µL H₂O₂检测缓冲液总体积达100 µL/孔。384孔板加入25 µL，总体积50 µL/孔

3.室温避光孵育15-30分钟

4.每孔加入50 µL Amplite™ Red工作液，总体积达150 µL/孔。384孔板加入25 µL，总体积75 µL/孔

5.室温避光孵育15-30分钟

6.使用荧光酶标仪检测：激发波长：540±10 nm、发射波长：590±10 nm、截止波长：570 nm（最合适Ex/Em=540/590 nm）

注意：也可以将反应液转移到白色透明底板中，用吸光度酶标仪在 576 ± 5 nm 的波长下读取。与荧光读数相比，吸光度检测的灵敏度较低。