Amplite 荧光法葡萄糖-6-磷酸检测试剂盒

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产品优势

在100 µL反应体系中可检测到低至0.3 µM的G6P。

 

适用范围

用于葡萄糖-6-磷酸（G6P）检测

 

产品介绍

葡萄糖-6-磷酸（G6P）是葡萄糖进入细胞的关键代谢中间体。它可在肝脏和肌肉中转化为糖原储存，也可通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）催化反应生成NADPH还原当量。这一过程在红细胞中尤为重要——G6PD缺乏会导致溶血性贫血。

AAT Bioquest品牌的Amplite®荧光法葡萄糖-6-磷酸检测试剂盒提供了一种简单、灵敏且快速的荧光检测方法，适用于血清、血浆、尿液及细胞培养样本等生物样品中的G6P检测。该检测采用酶偶联反应体系，G6P浓度与通过荧光NADPH传感器特异性检测的NADPH生成量成正比，结果可通过荧光酶标仪读取。实验证实，使用该试剂盒在100 µL反应体系中可检测到低至0.3 µM的G6P。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板
光吸收酶标仪
吸收:	575/605nm
推荐孔板:	透明底板

样品实验方案

简要概述

1.准备G6P工作溶液（50 µL）
2.添加G6P标准品或测试样品（50 µL）
3.在室温下孵育30分钟-2小时
4.监测Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）的荧光增加

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免反复冻融。
1.1 NADP储备溶液（100X）：
在NADP小瓶（组分C）中加入100 µL H2O，制成100X NADP储备溶液。

1.2 G6P标准溶液（100 mM）：
将100 µL H2O或1x PBS缓冲液加到G6P标准品（组分D）的小瓶中，制成100 mM G6P标准品溶液。

 

2.标准溶液

G6P标准
将10 µL 100 mM G6P标准溶液加到990 µL 1x PBS缓冲液中，生成1 mM G6P标准溶液。 然后，将100 µL 1 mM G6P标准溶液添加到900 µL 1 x PBS缓冲液中，制成100 µM G6P标准溶液（G6P7）。 取100 µM G6P标准溶液（G6P7）并进行1：3连续稀释，以使用1x PBS缓冲液连续稀释G6P标准溶液（G6P6- G6P1）。

注意：稀释的G6P标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

 

3.工作溶液

3.1将5 mL测定缓冲液（组分B）加入一瓶酶探针（组分A）中，并充分混合。

3.2将50 µL 100X NADP储备溶液添加到组分A + B的瓶子中，并充分混合以制成G6P工作溶液。

注意：此G6P工作溶液足以满足一个96孔板。

 

样品操作及实验分析

表1.黑色96孔微孔板中G6P标准品和测试样品的布局。 G6P = G6P标准品（G6P1-G6P7，0.14至100 µM），BL =空白对照，TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
G6P1	G6P1	...	...
G6P2	G6P2	...	...
G6P3	G6P3
G6P4	G6P4
G6P5	G6P5
G6P6	G6P6
G6P7	G6P7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
G6P1-G6P7	50ul	连续稀释（0.14至100 µM）
BL	50ul	稀释缓冲液
TS	50ul	测试样品

1.根据表1和2中提供的布局，准备G6P标准品（G6P），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 µL试剂代替50 µL。

2.在G6P标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50 µL G6P工作溶液，以使G6P测定总体积为100 µL /孔。 对于384孔板，将25 µL G6P工作溶液添加到每个孔中，总体积为50 µL /孔。

3.避光保存，室温下孵育反应30分钟至2小时。

4.使用荧光板读数器在激发= 530-570 nm，发射= 590-600 nm（佳Ex / Em = 540/590 nm，截止= 570nm）下监测荧光的增加。

注意：该板的内容物也可以转移到白色透明底板上，并通过吸光度酶标仪以A575nm / A605nm的比率进行读取。 与荧光读数相比，吸收检测的灵敏度较低。