Amplite 荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 红色荧光

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产品优势

能在155µL反应体积中可检测低至1.25 mU/mL的谷胱甘肽过氧化物酶活性。

 

适用范围

用于检测谷胱甘肽过氧化物酶

 

产品介绍

谷胱甘肽过氧化物酶是一类具有过氧化物酶活性的酶家族，其功能是保护机体免受氧化损伤。该酶在将有机过氧化物（如脂质过氧化物）还原为相应醇类，或将游离过氧化氢还原为水的过程中发挥关键作用。谷胱甘肽过氧化物酶能有效防止细胞膜及细胞内其他氧化敏感位点遭受氧化损伤，其水平变化与多种常见复杂疾病引发的病变密切相关。通过检测生物样本中谷胱甘肽过氧化物酶水平，可为癌症、糖尿病、神经退行性疾病和心血管疾病的潜在治疗方案提供重要指标。

AAT Bioquest公司推出的荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒，为生物样本中谷胱甘肽过氧化物酶水平的测定提供了高灵敏度荧光检测方案。该检测基于谷胱甘肽过氧化物酶催化谷胱甘肽（GSH）氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG）的反应过程。生成的GSSG在谷胱甘肽还原酶（GR）和NADPH作用下被循环还原为GSH，同时产生NADP+。

R-O-O-H + 2GSH     ^GPx             R-O-H + GSSG + H₂O

GSSG + NADPH + H^{+        GR}           2GSH + NADP⁺

 

本试剂盒采用我们最新开发的Quest Fluor™ NADP探针——一种专属性NADP荧光传感器，可特异性检测NADP+水平。该探针仅与NADP反应生成荧光产物，其荧光信号可通过荧光酶标仪检测，且信号强度与谷胱甘肽过氧化物酶活性成正比。相较于其他通过检测340nm处NADPH吸光度下降的商业试剂盒，我Quest Fluor™ NADP探针能直接定量NADP水平。该荧光检测体系在155µL反应体积中可检测低至1.25 mU/mL的谷胱甘肽过氧化物酶活性。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	420nm
Em:	480nm
Cutoff:	430nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

标准操作流程

操作步骤摘要

1.制备GPx标准品/测试样本（50 µL/孔）

2.加入GPx工作液（50 µL/孔）

3.室温孵育30分钟

4.加入20 µL Quest Fluor™ NADP探针

5.加入20 µL NADP检测溶液

6.室温孵育10-20分钟

7.加入15 µL增强剂溶液

8.室温孵育30-60分钟

9.荧光检测（激发/发射波长=420/480 nm，截止波长430 nm）

注意事项

1.为获得好的结果，强烈建议使用黑色微孔板

2.实验前需将所有试剂组分室温解冻

 

 

储备溶液配制

除特别说明外，所有未使用的储备液应分装为单次使用量，制备后保存于-20°C，避免反复冻融

谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）标准溶液（10 U/mL）

向GPx标准品（组分A）瓶中加入50 µL ddH₂O或1×PBS缓冲液，配制10 U/mL标准溶液

GSH储备液（100×）

向GSH（组分D）瓶中加入100 µL ddH₂O，配制100× GSH储备液

GPx底物储备液（100×）

向底物（组分E）瓶中加入100 µL ddH₂O，配制100× GPx底物储备液

 

标准溶液配制

可使用系列稀释计算器辅助配制：https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/11560

 

GPx标准曲线制备

1.取10 µL GPx标准溶液（10 U/mL）加入990 µL含0.1% BSA的1×PBS缓冲液，生成100 mU/mL GPx标准溶液（GP7）

2.以100 mU/mL标准溶液（GP7）为起始，用含0.1% BSA的PBS缓冲液按1:1.5梯度稀释，获得系列浓度标准品（GP6-GP1）

注：稀释后的GPx标准溶液稳定性差，需在4小时内使用

 

工作液配制方法

向酶混合液（组分C）瓶中加入5 mL检测缓冲液（组分B）

依次加入：50 µL GSH储备液（组分D）、50 µL GPx底物储备液（组分E）至B+C混合液中，充分混匀即得GPx工作液（组分B+C+D+E）

注意事项

本工作液配制量适用于1块96孔板实验

溶液稳定性差，需现配现用

强烈建议不要保存剩余工作液

 

表1. 纯黑色96孔微孔板中GPx标准品与测试样本
GP = GPx标准品（GP1-GP7，浓度梯度8.78-100 mU/mL）
BL = 空白对照
TS = 测试样本

BL	BL	TS	TS
GP1	GP1	...	...
GP2	GP2	...	...
GP3	GP3
GP4	GP4
GP5	GP5
GP6	GP6
GP7	GP7

 

表2. 各反应孔试剂组成

Well	Volume	Reagent
GP1 - GP7	50 µL	Serial Dilution (8.78 to 100 mU/mL)
BL	50 µL	1X PBS Buffer + 0.1% BSA
TS	50 µL	Test Sample

 

GPx反应步骤

1.按表1和表2布局配制GPx标准品(GP)、空白对照(BL)和测试样本(TS)。384孔板每孔加样25 µL（替代50 µL）

2.向各孔加入50 µL GPx工作液，总体积100 µL/孔（384孔板加25 µL，总体积50 µL/孔）

3.室温避光孵育30分钟

 

NADP检测步骤

1.每孔加入20 µL Quest Fluor™ NADP探针(组分F)，混匀

2.加入20 µL NADP检测溶液(组分G)并混匀（384孔板：样本25 µL+探针10 µL+检测液10 µL）

3.室温避光孵育10-20分钟

4.加入15 µL增强剂(组分H)，总体积155 µL/孔，室温避光孵育30-60分钟（384孔板加7.5 µL）

5.用荧光酶标仪检测荧光信号（激发/发射=420/480 nm，截止430 nm）