Amplite 荧光法羊抗鼠IgG-HRP偶联物ELISA检测试剂盒 红色荧光

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产品优势

可检测低至至10 pg/孔的微量单克隆抗体

 

适用范围

适用于以羊抗鼠IgG作为二抗的检测

 

产品介绍

辣根过氧化物酶（HRP）是一种分子量约40 KD的小分子酶，广泛应用于各类生物检测领域。HRP偶联物常作为ELISA、免疫组化技术以及Northern、Southern和Western印迹分析的二级检测试剂。得益于其小分子特性，HRP很少在抗体/抗原复合物形成过程中产生空间位阻问题。通常以4:1的比例与抗体偶联，且相比其他标记酶更具成本优势。但需注意的是，过氧化物酶对叠氮化钠等防腐剂耐受性较低，微量浓度即可导致酶活性丧失。

Amplite 荧光法羊抗鼠IgG-HRP偶联物ELISA检测试剂盒包含所有关键组分，其中专有的Amplite® Red荧光HRP底物可实现高灵敏度检测。该试剂盒提供优化的检测方案，兼容高通量液体处理系统，可检测低至至10 pg/孔的微量单克隆抗体。检测信号可通过荧光酶标仪或吸光酶标仪读取，特别适用于以羊抗鼠IgG作为二抗的检测体系。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.准备ELISA板
2.准备过氧化物酶工作溶液
3.将100μL/孔的过氧化物酶工作溶液加入ELISA板中
4.在室温下孵育15-60分钟
5.监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融。
1.1Amplite 红色过氧化物酶底物储备液（200X）：
将250μLDMSO（组分D）加入到Amplite 红色过氧化物酶底物（组分A）的小瓶中。

注意：50μL的Amplite 红色过氧化物酶底物原液足以用于1个平板。

1.2 H₂O₂储备溶液（20 mM）：
将22.7μL的3％H₂O₂（0.88M，组分B）加入977μL的测定缓冲液（组分C）中。

注意：稀释的H₂O₂储备溶液不稳定，应丢弃未使用的部分。

 

2.标准溶液

小鼠IgG标准
小鼠IgG（未包括）可用于产生标准曲线。 使用初始浓度3μg/ mL和1：3稀释因子，将0.2M碳酸氢钠缓冲液（pH9.4）的总小鼠IgG稀释到微量培养板中。

 

3.工作溶液

3.1 山羊抗小鼠IgG-HRP结合物工作液：
将2μL山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物（组分E）加入10mL含1％BSA的PBS（PBS-BSA，不包括在内）中。

注意：10 mL山羊抗小鼠IgG-HRP结合物工作溶液足以用于1个平板。 推荐该山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物工作溶液的浓度作为初始浓度。应根据经验确定每种特定应用的佳浓度。

3.2 过氧化物酶工作溶液：
将50μL的Amplite 红色过氧化物酶底物储备溶液（200X）和100μL的H₂O₂储备溶液（20mM）加入9.85mL的测定缓冲液（组分C）中以制备总体积为10mL的过氧化物酶工作溶液，避光。

 

样品分析

1.准备ELISA板：

1.1执行所有必要的ELISA准备步骤。

1.2用含有0.02％至0.05％Tween 20（PBS-Tween）和排液的PBS洗涤ELISA孔三次。

1.3向每个孔中加入100μL制备的山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物工作溶液。

1.4在室温下孵育30分钟。 排出HRP结合物。

1.5用PBS-Tween洗涤孔三次并排干。

 

2.在ELISA板中运行过氧化物酶测定：

2.1在含有样品和对照的每个排出的微孔板中加入100μL过氧化物酶工作溶液。

2.2在室温下孵育反应30分钟或更长时间，避光。

2.3用激发530-570nm（佳540nm）和发射590-600nm的荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以用吸光度酶标仪在576±5 nm的波长下读板。 然而，与荧光读数相比，吸收检测具有更低的灵敏度。