Amplite 荧光法组蛋白去乙酰化酶HDAC活性检测试剂盒 绿色荧光

产品货期

咨询

 

适用范围

用于组蛋白去乙酰化酶（HDAC）检测

 

产品介绍

组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一类能够去除组蛋白上ε-N-乙酰化赖氨酸乙酰基团的酶。去乙酰化可恢复赖氨酸残基的正电荷，从而增强组蛋白与DNA带负电的磷酸骨架的亲和力，进而阻碍转录因子结合，普遍抑制DNA转录。HDAC参与视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）抑制细胞增殖的调控通路——pRb通过募集HDAC至染色质，促使组蛋白去乙酰化。目前HDAC抑制剂已成为癌症治疗的重要研究方向

Amplite 荧光法组蛋白去乙酰化酶HDAC活性检测试剂盒提供了一种快速、灵敏的HDAC活性检测方案。其HDAC Green™底物较其他商业肽类底物具有更强的稳定性，适用于细胞裂解液活性检测、粗提物或纯化酶的体外抑制剂筛选。该底物凭借长波长发射（激发490nm/发射520nm）及高消光系数特性，可显著降低化合物及细胞组分的干扰。通过检测绿色荧光信号增强即可定量HDAC活性。

 

适用仪器

---

荧光酶标仪
Ex:	490nm
Em:	525nm
Cutoff:	515nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

概述

准备含有HDAC的样品（40μL）

添加HDAC抑制剂或测试化合物（10μL）

在室温或37℃孵育10-20分钟

添加HDAC Green 底物工作溶液（50μL）

在室温或37℃下孵育30-60分钟

监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度

注意：在开始实验之前解冻所有试剂盒组分。

 

操作方法

1.准备工作解决方案：

1.1制备含有HDAC的测试样品：在测定缓冲液（组分B）中以1:40稀释5-10mg / mL HeLa核提取物或细胞裂解物。

注意：40μL稀释样品足以用于96孔板的一个孔。 使用前立即稀释提取物。 将溶液储存在冰上。

1.2制备HDAC抑制剂（Trichostain A）溶液的稀释液：在测定缓冲液（组分B）中以1：100稀释3mM曲古菌素A溶液（组分C），得到30μM曲古抑菌素A溶液。向每个抑制剂对照孔中加入10μL30μM曲古抑菌素A溶液。

1.3制备HDAC Green 底物工作溶液：将20μLHDACGreen 底物（组分A）和100μL信号增强剂（组分D）加入5 mL测定缓冲液（组分B）中。

注意1：稀释的HDAC Green 底物工作溶液不稳定，5 mL稀释的HDAC Green 底物工作溶液足以进行100次分析。

注意2：为每个实验准备新鲜的HDAC Green 底物工作溶液。 将重构的工作溶液保存在冰上直至使用。

 

2.运行HDAC分析：

2.1将40μL稀释的核提取物，酶溶液或其他HDAC样品和10μL测试化合物加入相应的微孔板孔中（参见说明书中的表1）。

对于阳性对照：用10μL测定缓冲液（组分B）加入40μL稀释的HDAC酶溶液或HeLa核提取物（来自步骤1.1）。

对于阴性对照：添加40μL稀释的HeLa核提取物（来自步骤1.1）和10μL30μM曲古抑菌素A溶液（来自步骤1.2），或使用不含HDAC活性的已知样品。

对于空白（无酶）：仅添加50μL测定缓冲液（组分B）。

2.2将板在室温或37℃下孵育10-20分钟。

注意：为了筛选HDAC抑制剂，在添加HDAC Green 底物工作溶液之前，先用HeLa核提取物或纯酶预孵育这些化合物（参见步骤2.3）

2.3将50μLHDACGreen 底物工作溶液（来自步骤1.3）加入每个孔中。 将板在室温或37℃孵育30-60分钟。

2.4 Ex / Em = 490 / 525nm时的监测荧光强度。