Amplite 荧光法过氧化氢检测试剂盒 近红外荧光

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产品优势  

1.高效流程，"即混即读"型操作

2.荧光信号在pH 4-10范围内稳定性好

 

适用范围

用于过氧化氢检测

 

产品介绍

过氧化氢(H₂O₂)作为活性氧代谢的关键副产物，在氧化应激相关病理过程中起核心调控作用，与哮喘、动脉粥样硬化、糖尿病血管病变、骨质疏松及多种神经退行性疾病（包括唐氏综合征）的发生发展密切相关。最新研究发现，抗体可通过催化分子氧转化为H₂O₂参与免疫识别与清除机制，这一发现为理解免疫防御提供了新视角。精准检测H₂O₂水平对解析氧化应激如何调控细胞内信号通路具有重要价值。

本试剂盒采用专利Amplite® IR过氧化物酶底物，相比传统ADHP(Amplex Red™)具有显著优势：其荧光信号在pH 4-10范围内保持稳定，特别适用于低pH条件下的检测（ADHP在此环境下荧光效率显著降低）。Amplite® IR产物的最大吸收/发射波长为647/670 nm（近红外区），可有效避免生物样本在600 nm以下的自身荧光干扰。该"即混即读"型检测体系不仅能精准定量溶液和细胞裂解物中的H₂O₂，还可通过酶偶联反应检测多种氧化酶活性，完全兼容高通量液体处理系统。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	640nm
Em:	680nm
Cutoff:	665nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板的测定方案

概述

准备H₂O₂反应混合物（50μL）

加入H₂O₂标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育10-30分钟在Ex / Em = 540/590 nm处监测荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

 

操作方法

1.准备库存解决方案：

1.1100X Amplite 红色过氧化物酶底物原液：将250μLDMSO（组分E）加入到Amplite 红色底物（组分A）的小瓶中。 应及时使用原液; 任何剩余的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。

注意：避免反复冻融循环并避免光照。

1.220U / mL过氧化物酶储备溶液：将1mL测定缓冲液（组分C）加入到辣根过氧化物酶（组分D）的小瓶中。

注意：未使用的HRP溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。

1.320mM H₂O₂储备溶液：将22.7L的3％H₂O₂（0.88M，组分B）加入977L的测定缓冲液（组分C）中。

注意：稀释的H₂O₂溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。

 

2.准备H₂O₂反应混合物：

 

3.准备H₂O₂标准品（0至10μM）的连续稀释液：

注意1：在存硫醇如DTT和β-巯基乙醇的情况下，组分A不稳定。 高于10M（终浓度）的硫醇将显着降低测定动态范围。

注意2：NADH和谷胱甘肽（还原形式：GSH）可能会干扰检测。

3.1将1μL20mM H₂O₂溶液（来自步骤1.3）加入1999μL测定缓冲液（组分C）中，得到10μMH₂O₂标准品。

3.2取200μL10μMH₂O₂标准品进行1：3连续稀释，得到3，1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μMH₂O₂标准品系列稀释液。

3.3如说明书中表2和3中所述，将H₂O₂标准品和含H₂O₂的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

 

4.在上清液反应中进行H₂O₂测定：

4.1将50μLH₂O₂反应混合物（来自步骤2）加入到H₂O₂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总H₂O₂测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLH₂O₂反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15至30分钟，避光。

4.3在Ex / Em = 540±10/590±10nm（佳Ex / Em = 540 / 590nm）下用荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

 

5.对细胞进行H₂O₂检测：

Amplite 荧光过氧化氢检测试剂盒可用于测量细胞中H₂O₂的释放。 以下是建议的协议，可以进行修改以满足特定的研究需求。

5.1 H2O2反应混合物应按步骤2制备，但分析缓冲液（组分C）应替换为细胞培养系统中使用的培养基。建议的培养基包括（a）Krebs Ringers磷酸盐缓冲液（KRPB）;（b）汉克斯平衡盐溶液（HBSS）; 或（c）无血清培养基。

5.2在96孔板（50-100μL/孔）中制备细胞，并根据需要细胞。

注意：包括阴性对照（单独培养基和非活化细胞）用于测量背景荧光。

5.3将50μLH₂O₂反应混合物（来自步骤5.1）加入到细胞和H₂O₂标准品的每个孔中（来自步骤3.3）

5.4在室温下孵育反应15至30分钟，避光。

5.5用Ex / Em = 540±10/590±10nm（佳Ex / Em = 540 / 590nm）的荧光板读数器监测荧光增加。