Amplite 荧光法赖氨酰氧化酶（LOX）检测试剂盒 红色荧光

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产品优势

可检测低至sub ng/mL水平的LOX活性

 

适用范围

用于赖氨酰氧化酶（LOX）检测

 

产品介绍

赖氨酰氧化酶（LOX）是一种细胞外酶，能够催化胶原蛋白和弹性蛋白前体中赖氨酸残基形成醛基。这些醛基具有高度反应活性，可与其他LOX衍生的醛基残基或未修饰的赖氨酸残基发生自发化学反应，从而实现胶原蛋白和弹性蛋白的交联——这对胶原纤维的稳定化以及成熟弹性蛋白的结构完整性和弹性至关重要。LOX已被确认为潜在的肿瘤抑制因子。传统检测方法采用氚标记的胶原蛋白或弹性蛋白底物，通过氚释放终点法测定生物样本中LOX活性，该方法需进行繁琐的氚标记水真空蒸馏操作。

Amplite 荧光法赖氨酰氧化酶（LOX）检测试剂盒 红色荧光提供了一种高灵敏度的荧光检测法：采用专用LOX底物，在LOX氧化作用下释放过氧化氢，随后通过Amplite® HRP底物在HRP偶联反应中检测生成的过氧化氢。该方法可检测低至sub ng/mL水平的LOX活性，灵敏度高于现有荧光检测法，并能有效消除某些生物样本中的干扰物质，适用于细胞培养实验中的LOX活性检测。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

概述

准备测定反应混合物（50μL）

添加赖氨酰氧化酶标准品或测试样品（50μL）

在37℃孵育10-30分钟

在Ex / Em = 540/590 nm处监测荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

 

操作方法

1.准备试剂：

注意1：在硫醇如DTT，谷胱甘肽（还原型：GSH）和β-巯基乙醇存在下，Amplite™HRP底物不稳定。浓度高于10μM的硫醇的存在将显着降低测定动态范围。

注意2：某些洗涤剂（如Brij-35，Tween-20和NP40），NADH和NADPH也会干扰检测。

1.1 250X Amplite™HRP底物储备液：将100μLDMSO（组分D）加入到Amplite™HRP底物（组分A）的小瓶中。应及时使用原液; 任何未使用的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。

注意：避免反复冻融循环。

1.2 50U / mL辣根过氧化物酶储备溶液：将1mL测定缓冲液（组分B）加入到辣根过氧化物酶（组分C）的小瓶中。

注意：未使用的HRP溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.准备测定反应混合物：

根据说明书中的表格制备测定反应混合物并避光。

 

3.在上清液中进行赖氨酰氧化酶测定：

3.1将50μL测定反应混合物（来自步骤2）加入到赖氨酰氧化酶标准品，空白对照和测试样品（参见步骤2，表3）的每个孔中，以使总赖氨酰氧化酶测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL测定反应混合物。

3.2在37℃下孵育反应10至30分钟，避光。

3.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

 

4.对细胞进行赖氨酰氧化酶测定：

Amplite™荧光Lysyl氧化酶检测试剂盒可用于测量细胞中活性赖氨酰氧化酶的释放。 以下是建议的说明，可根据您的特定研究需求进行修改。

4.1在96孔板（50-100μL/孔）中制备细胞，并根据需要活化细胞。 

注意：包括阴性对照（单独培养基和非活化细胞）用于测量背景荧光。

4.2将50 µL赖氨酰氧化酶工作溶液添加到细胞培养基的每个孔中（来自上一步）和赖氨酰氧化酶标准品的孔中（参见表1）。 对于384孔板，请向每个孔中添加25 µL工作溶液。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL细胞培养基和25μL测定反应混合物。

4.3在37℃下孵育反应10至30分钟，避光。

4.4使用荧光读板仪在Ex / Em = 530至570/590至600 nm（大Ex / Em = 540/590 nm）下观察荧光增加。