Amplite NAD检测试剂盒 （荧光法）蓝色荧光

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产品优势  

1.在100 µL检测体系中可检测低至30 nM的NAD

2.即使存在过量NADH，也能检测0.3%的NAD生成量

3.兼容96孔或384孔微孔板，适用于高通量筛选

 

适用范围

用于总NAD检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）及其氧化形式（NAD）是生命体内多种酶促反应的关键辅因子。定量检测这些辅因子的生成或消耗，是监测酶促反应进程及筛选酶调节剂或底物的重要手段。目前市场上有多种试剂盒可定量检测NADH或总NAD/NADH含量，但在大量NADH存在的情况下检测NAD的生成一直颇具挑战——由于NAD仅在259 nm处有吸收峰且无荧光特性，传统检测方法难以实现。

Amplite®荧光法NAD检测试剂盒采用新型Quest Fluor™ NAD荧光探针，可对NAD进行灵敏、快速的直接检测。该试剂盒中的专属探针仅与NAD特异性反应，生成具有特定激发/发射光谱的荧光产物，且几乎不与NADH反应。在100 µL检测体系中可检测低至30 nM的NAD。即使存在过量NADH，也能检测0.3%的NAD生成量。兼容96孔或384孔微孔板，适用于高通量筛选

96孔板检测示例

概述

准备NAD标准品或测试样品（50μL）

添加20μLQuestFluor NAD探针添加20μL

测定溶液在室温下孵育10-20分钟

添加15μL增强剂溶液

在室温下孵育10-20分钟

监测420/480 nm的荧光 

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分。

 

操作步骤

1.准备NAD库存解决方案：

将500μlddH2 O加入到NAD标准品（组分D）的小瓶中以制备1mM NAD储备溶液。

注意：未使用的NAD储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。

 

2.准备NAD标准品的系列稀释液（0至10μM）：

2.1将10μLNAD储备溶液（来自步骤1）加入990L H2O或PBS缓冲液中以产生10M NAD标准溶液。

注意：稀释的NAD标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

2.2取200μL10μMNAD标准溶液，在H2O或PBS中进行1：3连续稀释，得到NAD标准品的10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM连续稀释液。

2.3如表1所述，将50μL系列稀释的NAD标准品和含有NAD的测试样品加入黑色/固体底96孔微孔板中：

 

表1在黑色/固体底96孔微孔板中的NAD标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注1：NS = NAD标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

注2：将连续稀释的NAD标准品从10μM加到0.01μM加入NS1至NS7的孔中，一式两份。

 

3.运行NAD测定：

 

3.1将20μLQuestFluor NAD探针（组分A）溶液加入NAD标准品，空白对照品和测试样品的每个孔中，充分混合。

3.2将20μL测定溶液（组分B）加入每个孔中，充分混合。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和10μLQuestFluor™NAD Probe和10μLAssaySolution。

3.3在室温下孵育反应10-20分钟，避光。

3.4向每个孔中加入15μL增强剂（组分C），使总NAD测定体积为105μL/孔，并在室温下孵育10-20分钟，避光。

注意：对于384孔板，添加7.5 uL增强剂。

3.5使用荧光板读数器在420/480 nm处检测荧光增加。