Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒（荧光法） 红色荧光

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注：该试剂盒含有酸性的提取液，如果样品含有大量蛋白，请脱蛋白后再使用，避免产生浑浊影响检测。可使用10KD的超滤管进行脱蛋白（超滤管货号：60502）

 

产品特点 

Amplite® 荧光法NAD/NADH比率检测试剂盒能够基于荧光信号，对生物样本中的NAD、NADH及其比率进行灵敏定量检测。

灵敏的循环检测：采用酶偶联循环反应，放大NAD/NADH的检测信号。

红色荧光读数：通过可见光范围的检测，有效降低背景干扰。

应用广泛：适用于代谢研究、线粒体功能测定及氧化还原状态分析。

 

适用范围

用于NAD/NADH比率检测

 

产品介绍

Amplite® 荧光法NAD/NADH比率检测试剂盒提供了一种基于荧光检测的灵敏、可靠方法，用于样本中NAD、NADH及其比率的定量分析。传统的NAD/NADH检测方法测定340 nm处的吸光度，通常需要紫外透射板，且灵敏度较低、易受干扰。

本试剂盒采用专利酶循环反应，可有效放大检测信号，并允许在红色可见光范围进行读取，有助于降低背景干扰。

该检测方法兼容96孔和384孔板，适用于高通量筛选、代谢谱分析、氧化还原状态评估及线粒体功能研究等科研应用。操作流程无需样品纯化，步骤简化，便于自动化操作并具有良好的重复性。采用红色荧光（Ex/Em = 540/590 nm）可确保检测的稳健性，且受样品组分干扰较小。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

概述

准备25μLNADH标准品和/或测试样品

添加25μLNADH或NAD提取溶液

在室温下孵育15分钟

加入25μLNAD或NADH萃取溶液

加入75μLNAD/ NADH反应混合物

在室温下孵育15分钟至2小时

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作方法

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.准备NAD / NADH反应混合物：

将10mL NADH传感器缓冲液（组分B）加入NAD / NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备连续稀释的NADH标准品（0至10μM）：

3.1将30μL1mMNADH储备溶液（来自步骤1）加入970μLPBS缓冲液（pH7.4）中，得到30μM（30pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL30M NADH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：3连续稀释，得到10,3,1,0.3,0.1,0.03和0 M系列稀释的NADH标准品。

3.3如表1和2中所述，将连续稀释的NADH标准品和/或含NAD / NADH的测试样品添加到固体黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1.实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS	TS (NADH)	TS (NADH)	TS (NAD)	TS (NAD)
NS1	NS1	….	….	….	….	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NAD / NADH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS（NADH）=用NADH萃取溶液处理10至15分钟的测试样品，然后用NAD萃取溶液中和; TS（NAD）=用NAD提取溶液处理10至15分钟的测试样品，然后用NADH提取溶液中和。

 

表2每个孔的试剂组成

NADH Standard	Blank Control	Test Sample (NAD/NADH)	Test Sample (NADH Extract)	Test Sample (NAD Extract)
Serial Dilutions*: 25 μL	PBS: 25 μL	Test Sample: 25 μL	Test Sample: 25 μL	Test Sample: 25 μL
Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component D: 25 μL	Component E: 25 μL
Incubate at room temperature for 10 to 15 minutes
Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component E: 25 μL	Component D: 25 μL
Total: 75 μL	Total: 75 μL	Total: 75 μL	Total: 75 μL	Total: 75 μL

*注意：将连续稀释的NADH标准品从0.03μM至30μM加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>300μM，终浓度）可能由于NADH传感器（非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

 

3.4对于NADH提取（NADH）：将25μLNADH提取溶液（组分D）加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。 在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNAD提取溶液（组分E）以中和NADH提取物，如表1和2中所述。

对于NAD提取（NAD）：将25μLNAD提取溶液（组分E）加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。 在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNADH提取溶液（组分D）以中和NAD提取物，如表1和2中所述。

对于总NAD和NADH：将25μLNAD/ NADH对照溶液（组分F）加入NADH标准品和含有NAD / NADH的测试样品的孔中。 在室温下孵育10至15分钟，然后如表1和2中所述添加25μL对照溶液（组分F）。

注意1：根据需要准备细胞或组织样本。 NAD / NADH裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

注意2：在健康的哺乳动物细胞中，与NADH相比，NAD更多，因此可以简单地使用总NAD和NADH减去NAD来计算NADH的量。

 

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定：

4.1将75μLNADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.4）的每个孔中，使得总NADH测定体积为150μL/孔。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值570nm）的荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

 

数据分析

        空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 典型数据如图1所示（总NAD和NADH与NAD或NADH提取物）。

图1.使用Gemini酶标仪（Molecular Devices），在96孔黑色板中用Amplite™NAD / NADH比率测定试剂盒测量总NADH和NAD及其提取物剂量响应。 用或不用NADH或NAD提取溶液处理25μL等量的NAD和NADH 15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。 在加入75μLNADH反应混合物后30分钟，在Ex / Em = 540 / 590nm（在570nm处截止）获得信号。 从具有NADH反应的那些孔的值中减去空白信号。 （注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的）。

 

附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂

 

1.植物细胞样品：

用裂解缓冲液以200mg / mL均化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

 

2.细菌样品：

离心收集细菌细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟， 用上清液进行试验。

 

3.哺乳动物细胞样本：

从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

 

4.组织样品：

称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。