Amplite NADH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光

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产品优势

通过酶循环反应精准识别NADH，提升检测灵敏度

适用范围

用于NADH检测

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）及其磷酸化形式烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP⁺）是细胞内两种关键的辅酶。NADH作为NAD⁺的还原形态，而NAD⁺则是NADH的氧化形态。当腺苷核苷酸2'位通过酯键连接磷酸基团后，即形成NADP⁺。该辅酶主要作为还原剂NADPH参与合成代谢过程，包括脂肪酸与核酸的生物合成。在叶绿体中，NADP⁺作为氧化剂参与光合作用初始反应，所产生的NADPH随后为光合作用卡尔文循环中的生物合成反应提供还原力。

传统检测方法通过监测340nm处NADH或NADPH的吸光度进行检测，但由于需在紫外波段使用昂贵的石英微孔板，该方法存在灵敏度低且干扰性强的缺陷。

Amplite® 荧光法NADH检测试剂盒提供了一种高灵敏度的NADH检测方案。检测系统中的特异性酶通过酶循环反应精准识别NADH，该反应机制可显著提升检测灵敏度。

适用仪器

96孔板测定示例

概述

准备NADH反应混合物（50μL）

加入NADH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟 -  2小时

监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度

1.准备NADH储备溶液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。
注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NADH反应混合物：
将10mL Amplite NADH测定缓冲液（组分B）加入NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。
注意：这种NADH反应混合物足以用于两个96孔或四个384孔板。未使用的NADH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至100μM）：
3.1将50μL的NADH储备溶液（来自步骤1）加入到450μLPBS缓冲液（pH 7.4）中以产生100μM（100pmol / L）NADH标准溶液。
注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL的100μMNADH标准溶液进行1：3连续稀释，得到30,1,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADH标准品系列稀释液。

3.3如表1和表2所述，将NADH标准品和含有NADH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中
注意：根据需要准备细胞或组织样本。

表1实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

表2每个孔的试剂组成

*注意：将连续稀释的NADH标准品（0.1μM至100μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份

4.在上清液反应中运行NADH测定：
4.1将50μL的NADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADH测定体积为100μL/孔
注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.3用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的荧光板读数器监测荧光增加（在Ex / Em = 540 / 590nm处佳）。
注1：也可将板的内容物转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。
注2：对于基于细胞的NADH测量，建议使用ReadiUse 哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（cat＃20012）裂解细胞。