Amplite NADP检测试剂盒（荧光法）蓝色荧光

产品货期

咨询

 

产品优势  

1.在100μL体系中对NADP的检测限低至30nM

2.可实现NADPH过量存在条件下0.3% NADP生成的精准监测

3.兼容96孔或384孔微孔板形式，特别适合高通量筛选应用。

 

适用范围

用于通用型蛋白激酶检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）及其磷酸化形式NADP+是细胞生命活动中至关重要的辅酶因子。NADP+由NAD+经腺苷核苷酸2'位磷酸酯化形成，作为还原力供体NADPH参与脂肪酸、核酸合成等生物合成反应。在叶绿体中，NADP+作为氧化剂参与光合作用初始反应，所产生的NADPH则为卡尔文循环中的生物合成反应提供还原力。定量检测这些辅酶的生成或消耗，是研究酶促反应及筛选酶调节剂/底物的重要手段。

目前市面上虽有多种可检测NADPH或NADP/NADPH总量的试剂盒，但在NADPH大量存在的情况下特异性检测NADP的生成一直极具挑战性——这是因为NADP仅在260nm处有吸收峰且不产生荧光，导致传统检测方法难以实际应用。

Amplite NADP检测试剂盒（荧光法）蓝色荧光 采用Quest Fluor™ NADP探针，能够直接、灵敏且快速地检测NADP：其特有的探针仅与NADP反应，在特定激发/发射光谱范围内产生荧光产物，而对NADPH几乎无响应；该试剂盒在100μL检测体积中可检测低至30nM的NADP，并能在过量NADPH存在下监测到0.3%的NADP生成。本检测方法兼容96孔或384孔微孔板形式，适用于高通量筛选。

 

96孔板检测示例

概述

准备NADP标准品或测试样品（50μL）

添加20μLQuestFluor™NADP探针

添加20μL测定溶液

在室温下孵育10-20分钟

添加15μL增强剂溶液

在室温下孵育10-20分钟，监测420/480 nm的荧光

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分。

 

操作步骤

1.准备NADP储备溶液：

将500μlddH2O加入到NADP标准品（组分D）的小瓶中以制备1mM NADP储备溶液。

注意：未使用的NADP储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。

 

2.准备NADP标准品的连续稀释液（0至10μM）：

2.1将10μL的NADP储备液（来自步骤1）加入到990L H2O或PBS缓冲液中以产生10M NADP标准溶液。

注意：稀释的NADP标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

2.2取200μL10μMNADP标准溶液，在H2O或PBS中进行1：3连续稀释，得到NADP标准品的10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM系列稀释液。

2.3如表1所述，将50μL系列稀释的NADP标准品和含有NADP的测试样品加入黑色/固体底96孔微孔板中：

 

表1黑色/固体底部96孔微孔板中NADP标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意1：NS = NADP标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

注意2：将连续稀释的NADP标准品（10μM至0.01μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。

 

3.运行NADP测定：

3.1将20μLQuestFluor NADP探针（组分A）溶液加入NADP标准品，空白对照品和测试样品的每个孔中，充分混合。

3.2将20μL测定溶液（组分B）加入每个孔中，充分混合。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和10μLQuestFluor™NADP探针和10μL分析溶液。

3.3在室温下孵育反应10-20分钟，避光。

3.4向每个孔中加入15μL增强剂（组分C），使总NADP测定体积为105μL/孔，并在室温下孵育10-20分钟，避光。

注意：对于384孔板，添加7.5 uL增强剂。

3.5使用荧光板读数器在420/480 nm处检测荧光增加。