Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒（荧光法） 红色荧光

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产品优势  

在可在96孔或384孔微孔板中便捷操作，无需分离步骤，轻松适配自动化检测系统

 

适用范围

用于NADP/NADPH比率检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）是细胞内两种重要的辅因子。NADH是NAD+的还原形式，而NAD+则是NADH的氧化形式。通过在腺苷酸2'位引入磷酸酯键，NAD+可转化为NADP+。NADP+主要参与合成代谢反应（如脂肪酸与核酸合成），这些反应需要还原剂NADPH的参与。统的NAD/NADH和NADP/NADPH检测方法通过监测340 nm处NADH或NADPH的吸光度来实现。由于该紫外波段检测需使用昂贵的石英微孔板，且存在灵敏度低、干扰性强等缺点。

Amplite® NADP/NADPH比率检测试剂盒提供了一种高灵敏度检测NADP、NADPH及其比值的便捷方案。该体系中的酶能特异性识别酶循环反应中的NAD/NADH，无需从样本混合物中纯化NADP/NADPH。酶循环反应使检测灵敏度显著提升，且反应在可见红光区进行，能大幅降低生物样本的干扰，实现超低背景值。

Amplite® NADP/NADPH比率检测试剂盒具有高灵敏度与低干扰特性，可在96孔或384孔微孔板中便捷操作，无需分离步骤，轻松适配自动化检测系统。

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荧光酶标仪
Ex:	540 nm
Em：	590 nm
Cutoff：	570 nm
推荐孔板:	黑色孔板

96孔板检测示例

概述

准备NADPH标准品或测试样品（25μL）

在室温下加入25μLNADPH或NADP提取液孵育15分钟

加入25μLNADP或NADPH提取液（25μL）

加入NADP / NADPH反应混合物（75μL）孵育于 室温保持15分钟 -  2小时

监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.制备NADP / NADPH反应混合物：

将10mL NADPH传感器缓冲液（组分B）加入NADP / NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至10μM）：

3.1将10μL1mMNADPH储备溶液（来自步骤1）加入990μLPBS缓冲液（pH7.4）中，得到10μM（10pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10M NADPH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：3连续稀释，得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0 M系列稀释液。

3.3如表1和2中所述，将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见，NADP / NADPH裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞。

 

表1.实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS	TS (NADPH)	TS (NADHP)	TS (NADP)	TS (NADP)
NS1	NS1	….	….	….	….	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADP / NADPH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS（NADPH）=用NADPH提取液处理10至15分钟的测试样品，然后用NADP提取溶液中和; TS（NADP）=用NADP提取溶液处理10至15分钟的测试样品，然后用NADPH提取溶液中和。

 

表2每个孔的试剂组成

NADPH Standard	Blank Control	Test Sample (NADP/NADPH)	Test Sample (NADPH Extract)	Test Sample (NADP Extract)
Serial Dilutions*: 25 μL	PBS: 25 μL	Test Sample: 25 μL	Test Sample: 25 μL	Test Sample: 25 μL
Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component D: 25 μL	Component E: 25 μL
Incubate at room temperature for 10 to 15 minutes
Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component E: 25 μL	Component D: 25 μL
Total: 75 μL	Total: 75 μL	Total: 75 μL	Total: 75 μL	Total: 75 μL

*注意：将连续稀释的NADPH标准品（0.01μM至3μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADPH（例如，>100μM，终浓度）可能由于NADPH传感器（对非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

 

3.4对于NADPH提取（NADPH）：将25μLNADPH提取溶液（组分D）加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μL的NADP提取溶液（组分E）以中和NADPH提取物，如表1和2中所述。

对于NADP提取（NADP）：将25μLNAP提取溶液（组分E）加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNADPH提取溶液（组分D）以中和NADP提取物，如表1和2中所述。

对于总NAPD和NADPH：将25μLNADP/ NADPH对照溶液（组分F）加入NADPH标准品的孔和含有NADP / NADPH的测试样品中。在室温下孵育10至15分钟，然后如表1和2中所述添加25μL对照溶液（组分F）。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。 NADP / NADPH裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞。

 

4.在上清液反应中运行NADP / NADPH测定：

4.1将75μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.4）的每个孔中，以使总NADPH测定体积为150μL/孔。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。