Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光

产品货期

咨询

 

产品优势  

在可在96孔或384孔微孔板中便捷操作，无需分离步骤，轻松适配自动化检测系统

 

适用范围

用于NAD/NADH比率检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）及其磷酸化衍生物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP⁺）是细胞中两类关键的辅酶。NADH作为NAD⁺的还原形态，而NAD⁺则是NADH的氧化形态。当腺苷核苷酸2'位通过酯键连接磷酸基团后，即形成NADP⁺。该辅酶主要参与需要还原剂NADPH的合成代谢过程，包括脂肪酸与核酸的生物合成。在叶绿体中，NADP⁺作为氧化剂参与光合作用的前期反应，所产生的NADPH随后为光合作用卡尔文循环中的生物合成反应提供还原力。传统检测方法通过监测340nm处NADH或NADPH的吸光度来分析NAD/NADH与NADP/NADPH。由于该方法需在紫外波段使用昂贵的石英微孔板，存在灵敏度低且干扰性强的技术局限。

Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法）红色荧光提供了一种便捷、高灵敏度的NADPH检测方法。其检测系统通过特异性酶介导的循环反应精准识别NADPH，该酶循环反应机制可大幅提升检测灵敏度。

 

适用仪器

---

荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

概述

准备NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟 -  2小时在Ex / Em = 540/590 nm处

监测荧光增加

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作方法

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.准备NADPH反应混合物：

将10mL Amplite™NADPH测定缓冲液（组分B）加入NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADPH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至100μM）：

3.1将50μLNADPH储备液（来自步骤1）加入450μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，得到100μM（100pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL100μMNADPH标准溶液，进行1：3连续稀释，得到30,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADPH标准品系列稀释液。

3.3如表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADPH的测试样品的系列稀释液加入到实心黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

 

表2每个孔的试剂组成

NADPH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

*注意：将连续稀释的NADPH标准品（0.1μM至100μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份

 

4.在上清液反应中运行NADPH测定：

4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（（佳Ex / Em = 540 / 590nm）下用荧光板读数器监测荧光增加。

注意1：平板的内容物也可以转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2：对于基于细胞的NADPH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（cat＃20012）裂解细胞。