Amplite 总NAD和NADH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光

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产品优势

通过酶循环反应精准识别NAD / NADH，无需从样品混合物中纯化。

 

适用范围

用于总NAD和NADH检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）及其磷酸化形式（NADP⁺）是细胞内至关重要的辅酶对。NADH作为NAD⁺的还原态，NAD⁺则是NADH的氧化态。当腺苷核苷酸2'位通过酯键连接磷酸基团后，即形成NADP⁺。该辅酶不仅作为还原剂NADPH参与脂肪酸与核酸合成等合成代谢过程，还在叶绿体中作为氧化剂驱动光合作用光反应，其还原产物NADPH为卡尔文循环的碳固定反应提供必需还原力。传统检测方法通过监测340nm处NAD(P)H吸收值进行分析，但因需使用昂贵的石英微孔板且在紫外区检测，存在灵敏度低、干扰性强等固有局限。

Amplite 总NAD和NADH检测试剂盒（荧光法）红色荧光提供了一种便捷、高灵敏度的NAD和NADH检测方法。检测系统中的特异性酶通过酶循环反应精准识别NAD/NADH，无需对样本进行预先纯化。该酶循环反应可显著提高检测灵敏度。此外，由于检测在可见红光区进行（激发波长570nm/发射波长590nm），能大幅降低生物样本的干扰，具有极低的背景值。实际检测表明，该试剂盒具有高灵敏度和低干扰的特性。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

 

概述

准备NAD / NADH反应混合物（50μL）

添加NADH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟--2小时

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

 

操作方法

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物：

将10mL NAD / NADH传感器缓冲液（组分B）加入NAD / NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至10μM）：

3.1将10μL的NADH储备溶液（来自步骤1）加入到990L PBS缓冲液（pH 7.4）中，以产生10μM（10pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10μMNADH标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

 

表2.每个孔的试剂组成

NADH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

注意：将连续稀释的NADH标准品（0.01μM至10μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，终浓度）可能由于NADH传感器（对非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

 

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定：

4.1将50μL的NADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.3）的每个孔中，使得总NADH测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。

注1：也可将板的内容物转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2：对于NAD / NADH比率测量，建议使用试剂盒15263。

注意3：对于基于细胞的NAD / NADH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（目录号20012）裂解细胞。